環(huán)形RNA?(circular RNAs, circRNAs) 在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是非編碼RNA，但近兩年有越來越多的證據(jù)表明其可以翻譯，目前環(huán)形RNA翻譯蛋白質(zhì)（多肽）也成了最熱門的研究方向之一。大強(qiáng)今天會(huì)根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)文章歸納一個(gè)基礎(chǔ)的研究思路和策略，以供大家參考。

研究策略 | 環(huán)形RNA的翻譯-肽度TIMEDOO

鑒定驗(yàn)證環(huán)形RNA可以翻譯，主要考慮大規(guī)模鑒定、序列翻譯能力、內(nèi)源蛋白檢測(cè)、翻譯的調(diào)控和功能研究幾個(gè)方面。
大規(guī)模鑒定翻譯（蛋白質(zhì)合成）主要是在核糖體中進(jìn)行的，且正在翻譯的RNA分子傾向于結(jié)合多個(gè)核糖體單體（多聚體，polysomes），因此想辦法固定核糖體和RNA后，從細(xì)胞裂解液里分離核糖體組分，再對(duì)其攜帶的RNA進(jìn)行分析，就有可能批量化發(fā)現(xiàn)可以翻譯或正在翻譯的RNA。

實(shí)驗(yàn)中可以使用放線菌酮（Cycloheximide）或三尖杉酯堿（Harringtonine）抑制翻譯進(jìn)行，之后裂解細(xì)胞，然后以蔗糖密度梯度離心分離不同組分（polysome profiling），接著從polysomes組分中分離RNA。或者以30%的蔗糖溶液進(jìn)行離心分離RNC沉淀（full-length translating mRNA profiling），接著從RNA沉淀中分離RNA。再對(duì)分離的RNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，測(cè)序之前進(jìn)行RNase R消化以富集環(huán)形RNA是一個(gè)可選項(xiàng)。另外可以分離核糖體后先使用低濃度的RNase T1進(jìn)行消化（ribosome profiling），然后分離核糖體單體亞基之間被保護(hù)的RNA片段（ribosome footprints, RFPs）。再對(duì)這些RNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序，從測(cè)序reads中搜索符合環(huán)形RNA的backspliced junction。

另外有文章報(bào)道甲基化修飾m6A可以促進(jìn)環(huán)形RNA翻譯，因此可以提取total RNA后使用m6A抗體做IP，富集含m6A的RNA，之后進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

序列翻譯能力分析具體的環(huán)形RNA是否翻譯，可以利用現(xiàn)有的算法工具或軟件分析是否有合適的ORF，為排除假陽(yáng)性或與線性RNA的同源干擾，可以只關(guān)注ORF跨越backspliced junction的環(huán)形RNA。接著分析對(duì)應(yīng)的氨基酸序列特征以及翻譯的可能性。然后分析RNA和氨基酸序列在多物種中的保守性。

分析后需要實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明待定的環(huán)形RNA可以翻譯，因此需要構(gòu)建環(huán)形RNA的過表達(dá)載體，以及添加標(biāo)簽（如3xFlag）、刪除ATG、刪除下游IR和對(duì)應(yīng)ORF線性翻譯的陽(yáng)性對(duì)照載體等。翻譯驗(yàn)證可以先使用RRL等體外翻譯系統(tǒng)，再轉(zhuǎn)染細(xì)胞或使用AAV注射小鼠后進(jìn)行檢測(cè)，初步證明預(yù)測(cè)的環(huán)形RNA及ORF可以翻譯。

接下來分析驗(yàn)證環(huán)形RNA和核糖體的結(jié)合，可以使用蔗糖密度梯度離心分離不同的核糖體組分，然后以RT-PCR檢測(cè)組分中的環(huán)形RNA。

最后還要分析序列翻譯的起始機(jī)制，最常見的是考慮IRES介導(dǎo)，可以使用現(xiàn)有的工具（如circBank、circRNADb數(shù)據(jù)庫(kù)）預(yù)測(cè)序列中的IRES活性片段，再構(gòu)建報(bào)告載體驗(yàn)證IRES活性。也有考慮m6A介導(dǎo)的翻譯，可以預(yù)測(cè)m6A位點(diǎn)，并構(gòu)建野生型和位點(diǎn)突變型載體進(jìn)行驗(yàn)證。

內(nèi)源蛋白檢測(cè)初步確認(rèn)環(huán)形RNA可以翻譯后，還需要在細(xì)胞系或動(dòng)物體中檢測(cè)到內(nèi)源的蛋白質(zhì)（多肽）?？梢远ㄖ撇Ⅱ?yàn)證高特異性的抗體，然后進(jìn)行免疫組化和Western blot檢測(cè)。有需要時(shí)可以增加過表達(dá)和siRNA等分組，注意應(yīng)同步檢測(cè)對(duì)應(yīng)的環(huán)形RNA。

之后可以使用定制的特異性抗體進(jìn)行IP，富集目的條帶后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)（液相-二級(jí)質(zhì)譜串聯(lián)，LC-MS/MS），以驗(yàn)證確認(rèn)相應(yīng)的肽段（氨基酸序列）。

另外可以補(bǔ)充驗(yàn)證環(huán)形RNA或環(huán)形RNA翻譯的蛋白質(zhì)與翻譯起始因子的互作，如與IRES介導(dǎo)對(duì)應(yīng)的eIF4G或ITAF，以及與m6A介導(dǎo)對(duì)應(yīng)的YTHDF1/2/3等。

翻譯的調(diào)控以IRES或m6A介導(dǎo)的環(huán)形RNA翻譯都是cap-independent translation，因此也有必要驗(yàn)證特定的刺激或蛋白可以調(diào)控這種翻譯。例如熱應(yīng)激或饑餓處理，以及eIF4E、4E-BP、FOXO、FTO、METTL3/14等。
功能研究功能研究的策略和套路很多，就不贅述了，需要注意很多時(shí)候RNA和對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的豐度并不一致或不呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，因此功能研究可能需要區(qū)分可翻譯的環(huán)形RNA以及其翻譯的蛋白質(zhì)。

來源：circRNA