實驗中可以使用放線菌酮（Cycloheximide）或三尖杉酯堿（Harringtonine）抑制翻譯進行，之后裂解細胞，然后以蔗糖密度梯度離心分離不同組分（polysome profiling），接著從polysomes組分中分離RNA?；蛘咭?0%的蔗糖溶液進行離心分離RNC沉淀（full-length translating mRNA profiling），接著從RNA沉淀中分離RNA。再對分離的RNA進行高通量測序分析，測序之前進行RNase R消化以富集環(huán)形RNA是一個可選項。另外可以分離核糖體后先使用低濃度的RNase T1進行消化（ribosome profiling），然后分離核糖體單體亞基之間被保護的RNA片段（ribosome footprints, RFPs）。再對這些RNA片段進行高通量測序，從測序reads中搜索符合環(huán)形RNA的backspliced junction。

另外有文章報道甲基化修飾m6A可以促進環(huán)形RNA翻譯，因此可以提取total RNA后使用m6A抗體做IP，富集含m6A的RNA，之后進行高通量測序分析。

分析后需要實驗證據(jù)證明待定的環(huán)形RNA可以翻譯，因此需要構建環(huán)形RNA的過表達載體，以及添加標簽（如3xFlag）、刪除ATG、刪除下游IR和對應ORF線性翻譯的陽性對照載體等。翻譯驗證可以先使用RRL等體外翻譯系統(tǒng)，再轉染細胞或使用AAV注射小鼠后進行檢測，初步證明預測的環(huán)形RNA及ORF可以翻譯。

接下來分析驗證環(huán)形RNA和核糖體的結合，可以使用蔗糖密度梯度離心分離不同的核糖體組分，然后以RT-PCR檢測組分中的環(huán)形RNA。

最后還要分析序列翻譯的起始機制，最常見的是考慮IRES介導，可以使用現(xiàn)有的工具（如circBank、circRNADb數(shù)據(jù)庫）預測序列中的IRES活性片段，再構建報告載體驗證IRES活性。也有考慮m6A介導的翻譯，可以預測m6A位點，并構建野生型和位點突變型載體進行驗證。

之后可以使用定制的特異性抗體進行IP，富集目的條帶后進行質譜檢測（液相-二級質譜串聯(lián)，LC-MS/MS），以驗證確認相應的肽段（氨基酸序列）。

另外可以補充驗證環(huán)形RNA或環(huán)形RNA翻譯的蛋白質與翻譯起始因子的互作，如與IRES介導對應的eIF4G或ITAF，以及與m6A介導對應的YTHDF1/2/3等。

來源：circRNA