Nature重磅丨抗miR-17寡核苷酸RGLS4326用于治療多囊腎的發(fā)現(xiàn)和臨床前評價-肽度TIMEDOO

常染色體顯性多囊腎?。ˋDPKD）是由PKD1或PKD2基因突變引起，也是人類最常見的單基因疾病之一，也是終末期腎臟疾病的主要遺傳原因。ADPKD臨床特征是因大量充滿液體的囊腫，使腎臟逐漸進(jìn)行性雙側(cè)腫大，而PKD1或PKD2基因突變導(dǎo)致腎小管上皮過度增殖，從而導(dǎo)致囊腫形成。全球超過1200萬人患有ADPKD，使其成為最常見的單基因疾病，到60歲百分之五十的ADPKD患者最終會發(fā)展為終末期腎?。‥SRD），分別占?xì)W洲和美國ESRD患病患者的10％和5％。不幸的是，這種威脅生命的疾病的治療選擇仍然非常有限。
美國Regulus Therapeutics公司的Edmund C. Lee和德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的Vishal Patel等科學(xué)家最近在Nature Communication發(fā)表了題為Discovery and preclinical evaluation of anti-miR-17 oligonucleotide RGLS4326 for the treatment of polycystic kidney disease的文章，通過miRNA文庫篩選發(fā)現(xiàn)了用于ADPKD的潛在治療的RGLS4326，一種microRNA-17（miR-17）的first-in-class的短寡核苷酸抑制劑，它優(yōu)先分布于腎臟并收集源自導(dǎo)管的囊腫，從翻譯活性多核糖體中置換出miR-17，并抑制多種miR-17 mRNA靶標(biāo)，包括Pkd1和Pkd2。該抑制劑在動物實驗中表現(xiàn)了良好的臨床安全性和治療效果，有望成為ADPKD治療的一種有效且理想的方法。

什么是miRNA及其治療途徑？

miRNA是進(jìn)化保守的約20個核苷酸長（nt）的非編碼RNA，可作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后抑制劑。種子序列（主要位于miRNA的5’端N2-至N8核苷酸（N）位置）和互補(bǔ)序列（主要位于3’非翻譯區(qū)（3’UTR）之間）的Watson-Crick堿基配對mRNA）導(dǎo)致目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯抑制和最終降解。miRNA異常激活可促進(jìn)多種人類疾病的發(fā)展，與特定病原性miRNA完全互補(bǔ)的18-21nt的長抗miR已被證明可以減弱疾病的進(jìn)展。近年來，miRNA抑制已成為一種有吸引力的治療策略，經(jīng)過化學(xué)合成和修飾的單鏈寡核苷酸抗microRNA（anti-miRs）可抑制miRNA并抑制下游靶標(biāo)mRNA和編碼蛋白。
研究人員發(fā)現(xiàn)， miR-17 miRNA家族在人和鼠形式的ADPKD中均被上調(diào)，并且它們的缺失或抑制減弱了小鼠PKD模型中的囊腫生長。miR-17家族源自三個多順反子簇：miR-17?92，miR-106a?363和miR-106b?25簇。在這三個基因中，miR-17?92對胚胎發(fā)育至關(guān)重要，并以其作為癌基因的作用而聞名。miR-17?92的種系敲除會導(dǎo)致圍產(chǎn)期致死，并伴有骨骼，心臟，肺和B細(xì)胞的成熟缺陷，而miR-106a?363或miR-106b?25簇的缺失不會產(chǎn)生任何明顯的異常。在腎臟內(nèi)，小鼠腎臟祖細(xì)胞中的miR-17?92缺失會損害腎臟的生成24。然而，這些簇的表達(dá)隨著成熟而下降，因此，成年小鼠中miR-17?92的誘導(dǎo)型缺失除了降低成熟造血譜系外，不影響其壽命或總體健康狀況。腎臟特定的miR-17?92簇缺失也不會在腎臟的形態(tài)和組織學(xué)上產(chǎn)生任何明顯的缺陷。因此，在產(chǎn)后腎臟中優(yōu)先靶向miR-17家族是治療ADPKD的一種有吸引力的治療方法。

如何發(fā)現(xiàn)抗miR-17寡核苷酸RGLS4326？

研究人員通過篩選抗miR-17寡核苷酸化學(xué)多樣性的文庫來發(fā)現(xiàn)RGLS4326，以獲得最佳藥物特性，包括功效、穩(wěn)定性、安全性、藥代動力學(xué)-藥效學(xué)特征以及全身給藥后可優(yōu)先分配至腎臟并賦予治療功效的能力。該文庫包含> 190個不同長度的寡核苷酸，堿基序列（針對成熟miR-17的位置互補(bǔ)）和化學(xué)修飾。將HeLa細(xì)胞與螢光素酶報道載體和外源性miR-17表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，載體起抑制螢光素酶信號的作用，再分別用文庫中的抗miR-17寡核苷酸分別處理HeLa細(xì)胞，螯合miR-17和抑制熒光素酶信號。
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圖1. 發(fā)現(xiàn)RGLS4326的過程：一種化學(xué)修飾的miR-17寡核苷酸抑制劑

RGLS4326抑制miR-17并抑制直接的mRNA靶標(biāo)

RGLS4326在HeLa細(xì)胞中抑制miR-17功能并降低其miR-17熒光素酶傳感器的活性，EC50值為28.3±4.0±nM。正如其與miR-17家族種子區(qū)域的序列互補(bǔ)性所預(yù)期的那樣，RGLS4326還抑制了其他miR-17家族成員（包括miR-20b，miR-93和miR-106a）的螢光素酶傳感器活性，但不是無關(guān)的miRNA，例如miR-33b。除了常用的螢光素酶傳感器分析，通常通過測量單個下游靶基因的去阻抑來評估m(xù)iRNA的功能抑制。單個miRNA靶基因的變化通常很小，很大程度上取決于細(xì)胞類型。
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圖2. RGLS4326抑制miR-17并抑制直接miR-17靶標(biāo)。

RGLS4326抑制人類原發(fā)性ADPKD囊腫生長和優(yōu)先分布于腎臟

通過利用來自人類ADPKD供體的原代囊腫培養(yǎng)物，觀察到在RGLS4326處理的非ADPKD腎細(xì)胞中沒有miR-17抑制明顯的細(xì)胞毒性。接下來，研究人員評估了單次30μmg/ kg-1 SC注射后，RGLS4326在野生型小鼠中的體內(nèi)藥代動力學(xué)和生物分布特征。RGLS4326被迅速吸收到血漿中，表現(xiàn)出Tmax≤1h，Cmax 8.5μgmL-1，半衰期<4 h。值得注意的是，RGLS4326表現(xiàn)出優(yōu)先的腎臟分布，Cmax和AUClast分別顯示腎與肝（K / L）的比率分別約為13和8。定量全身放射自顯影（QWBA）研究的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，在單次SC給藥后，RGLS4326主要分布在腎臟上，而大部分給藥劑量在尿液中消除了。在腎臟中，已知化學(xué)修飾的寡核苷酸主要通過基底外側(cè)攝取和腎小管重吸收而定位于近端小管，而腎小球的定位極少。
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圖3. RGLS4326的藥代動力學(xué)、組織分布和藥效學(xué)特征

RGLS4326改善PKD中失調(diào)的基因網(wǎng)絡(luò)表達(dá)

為了進(jìn)一步了解PKD治療中RGLS4326的作用機(jī)制（MOA），研究人員首先比較了RGLS4326治療后的Pkd2-KO和Pcy / CD1模型中的腎臟總體mRNA表達(dá)譜與各自的PBS-處理過的對照組。研究發(fā)現(xiàn)，RGLS4326治療在兩個PKD模型的囊性腎臟中均具有顯著的轉(zhuǎn)錄組范圍影響，并且全局抑制了預(yù)期的miR-17靶基因的mRNA。
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圖4. RGLS4326改善PKD模型中失調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)

RGLS4326的臨床前安全性評估

研究人員接下來對RGLS4326的臨床前安全性進(jìn)行了評估。由于含有2′-脫氧-2′-氟核苷的寡核苷酸具有抑制DNA修復(fù)和誘導(dǎo)線粒體毒性的潛力，實驗評估了包含三個2′-脫氧-2′-氟核苷的RGLS4326的遺傳毒性和線粒體毒性潛力。每天三劑最高劑量達(dá)2000 mg kg-1的小鼠在細(xì)菌誘變分析、體外人淋巴細(xì)胞微核分析或體內(nèi)微核和彗星分析中均未觀察到遺傳毒性。在需要線粒體氧化代謝的條件下，人體細(xì)胞體外實驗也未觀察到線粒體毒性，而在體內(nèi)，通過電鏡檢查注射了RGLS4326的猴子的肝臟和線粒體心臟組織也未觀察到線粒體毒性。
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圖5. RGLS4326不會對猴子造成造血或腎臟毒性。

研究結(jié)果及意義

與傳統(tǒng)藥物相比，基于miRNA的藥物具有獨(dú)特的MOA。miRNA同時抑制許多mRNA靶標(biāo)，從而影響多種信號通路。此外，miRNA起到變阻器的作用，而不是通斷開關(guān)。傳統(tǒng)藥物通常會抑制（或激活）單個或幾個途徑，而基于miRNA的治療劑可以全面調(diào)節(jié)多個途徑。
此項研究表明，RGLS4326處理可改善PKD中許多致病基因網(wǎng)絡(luò)和途徑的表達(dá)。重要的是，這種多囊腎轉(zhuǎn)錄組向正常腎臟分布的協(xié)調(diào)重新布線，說明了RGLS4326作為ADPKD疾病緩解療法的潛力。RGLS4326最吸引人的功能之一就是它與ADPKD的潛在直接機(jī)械聯(lián)系。研究表明，miR-17與PKD1和PKD2的3’UTR結(jié)合并抑制它們的表達(dá)。顯而易見，抗miR-17寡核苷酸RGLS4326具有良好的效價、穩(wěn)定性、安全性、藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特性，包括優(yōu)先分配至腎臟，在體內(nèi)可在多種PKD小鼠模型中有效，該研究有力地支持了針對ADPKD的RGLS4326的臨床開發(fā)。
來源：銳博生物
原文鏈接：Edmund C. Lee, et al. Discovery and preclinical evaluation of anti-miR-17 oligonucleotide RGLS4326 for the treatment of polycystic kidney disease. Nature Communications, volume 10, Article number: 4148 (2019)

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-11918-y