CNAF嘉賓丨Gunter Meister-德國(guó)雷根斯堡大學(xué)生物化學(xué)系教授
本期嘉賓介紹
Gunter Meister
德國(guó)雷根斯堡大學(xué)生物化學(xué)系教授兼主任
報(bào)告主題: Gene Regulation Mediated by Non-coding RNAs, RNA Binding Proteins and RNA Modifications
報(bào)告摘要：基因表達(dá)不僅在轉(zhuǎn)錄層面受到調(diào)控，在許多轉(zhuǎn)錄后步驟也受到調(diào)控。實(shí)驗(yàn)證明，各種類型的非編碼RNA對(duì)于正確的基因表達(dá)至關(guān)重要。非編碼RNA包括microRNA、lncRNA和circRNA，它們通過選擇性剪接產(chǎn)生，可以充當(dāng)miRNA或RNA結(jié)合蛋白海綿。RNA不以單一的RNA分子形式發(fā)揮作用，而是作為RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成要素，在這些復(fù)合物中至少有一種RNA結(jié)合蛋白（RBP）直接與RNA作用。因此，RBP對(duì)RNA代謝至關(guān)重要，是協(xié)調(diào)各種RNA結(jié)合過程的調(diào)控中心。此過程的調(diào)控不當(dāng)通常與疾病有關(guān)，但在此前并未引起重視。最近，Meister實(shí)驗(yàn)室分析了RBP在共轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)miRNA表達(dá)的調(diào)控。此外，他們已經(jīng)開始研究RNA修飾途徑及其與人體細(xì)胞中其他細(xì)胞RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的串?dāng)_。Gunter會(huì)在論壇現(xiàn)場(chǎng)報(bào)告他們?cè)赗BP功能方面的最新進(jìn)展，包括RNA堿基修飾的readers 和writers，還會(huì)介紹其用于研究RNA修飾的工具。
在目前正在進(jìn)行的項(xiàng)目中，他們研究關(guān)鍵miRNA生物發(fā)生以及效應(yīng)蛋白的翻譯后修飾。兩個(gè)關(guān)鍵問題是：哪些信號(hào)通路和激酶或磷酸酶作用于這些因子？特定位點(diǎn)磷酸化的生物后果是什么？
除了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中小RNA途徑的生化表征，該實(shí)驗(yàn)室還利用RNA克隆和深度測(cè)序分析癌癥中的短鏈非編碼RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA。通過與雷根斯堡大學(xué)醫(yī)院Christina Hackl教授的緊密合作，他們研究了結(jié)直腸癌進(jìn)展中的非編碼RNA；還與Peter Hau教授一起對(duì)惡性膠質(zhì)瘤患者的非編碼RNA進(jìn)行了分析。
此外，他們鑒定和表征了與特定miRNA前體分子相互作用的RNA結(jié)合蛋白。使用生化方法，他們鑒定了數(shù)百種與特定序列結(jié)合pre-miRNA的蛋白質(zhì)，目前正在研究這些蛋白質(zhì)的生物功能。擁有最先進(jìn)的技術(shù)，例如CRISPR / Cas9敲除或RNA結(jié)合基序（bind’n’seq）的體外選擇，他們還在研究全新的RNA結(jié)合蛋白和RNA結(jié)合域。
最后，他們表征了RNA分子的特異性修飾，m6Adenin（m6A）抗體可以更好地表征這種修飾。有趣的是，這種修飾常見于mRNA，并且擁有許多有趣的生物功能。在其項(xiàng)目中，他們表征了在這種修飾途徑中起作用的酶和RNA結(jié)合蛋白。另外，他們開發(fā)了針對(duì)十種不同堿基修飾的單克隆抗體。借助這些工具，他們希望將此類修飾映射到RNA分子上、不斷完善對(duì)RNA堿基修飾機(jī)理的認(rèn)識(shí)。
小RNA途徑的翻譯后調(diào)控
翻譯后修飾存在于許多蛋白質(zhì)，并有助于基因產(chǎn)物的功能多樣化。Meister實(shí)驗(yàn)室的目的是對(duì)miRNA途徑關(guān)鍵成分的翻譯后修飾進(jìn)行分類和功能表征，使用最先進(jìn)的定量質(zhì)譜技術(shù)對(duì)修飾進(jìn)行鑒定和絕對(duì)定量，例如甲基化或磷酸化。為了進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)研究，他們對(duì)miRNA途徑所有關(guān)鍵成分開發(fā)了單克隆抗體，在miRNA途徑的Drosha、Xpo-5、Lin28等因子上定位磷酸化位點(diǎn)，并在功能上表征Ago和TNRC6蛋白上已鑒定的磷酸化位點(diǎn)。除此之外，他們還研究信號(hào)通路和依賴磷酸化相互作用的RNA和蛋白。
非編碼RNA在癌癥中的分析
MicroRNA（miRNA）是一種重要的基因調(diào)節(jié)劑，與mRNA上抑制基因表達(dá)的結(jié)合位點(diǎn)相互作用。根據(jù)調(diào)控靶標(biāo)的不同，miRNA可以充當(dāng)腫瘤基因或者腫瘤抑制基因。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）與包括癌癥在內(nèi)的各種疾病密切相關(guān)。
目前，一種基于競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）的新型“ RNA語(yǔ)言”模型已經(jīng)提出，ceRNA與mRNA競(jìng)爭(zhēng)miRNA，并且可以調(diào)節(jié)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組。但是，業(yè)界對(duì)于轉(zhuǎn)移和治療過程中miRNA和lncRNA之間的相互作用依然知之甚少。最近，該實(shí)驗(yàn)室正在對(duì)癌癥進(jìn)展過程中的環(huán)狀RNA分子進(jìn)行表征。在此項(xiàng)目中，他們使用不同的小鼠模型（BALBneuT和結(jié)腸直腸癌的原位模型），通過深度測(cè)序分析癌癥進(jìn)展和治療干預(yù)期間的miRNA、lncRNA和circRNA表達(dá)，表征原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤之間非編碼RNA表達(dá)的變化，同時(shí)鑒定包括推定的ceRNA在內(nèi)的MiRNA靶標(biāo)并分析其在體外和體內(nèi)的相關(guān)性。
RNA結(jié)合蛋白對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控
編碼RNA和非編碼RNA的調(diào)控水平各不相同，例如，microRNA（miRNA）的表達(dá)可以在生物合成的多個(gè)步驟受到影響。此外，直接RNA甲基化也會(huì)影響許多不同生物和系統(tǒng)中的基因表達(dá)。Meister實(shí)驗(yàn)室的部分項(xiàng)目旨在鑒定和表征影響miRNA成熟的因素。例如，他們采用生化下拉分析法分離不同miRNA物種的特定結(jié)合蛋白、使用分子或細(xì)胞生物學(xué)方法分析這些因素的生理作用、使用X射線晶體學(xué)及其他生物化學(xué)和生物物理方法分析miRNA與蛋白質(zhì)相互作用的分子細(xì)節(jié)。
最近，該實(shí)驗(yàn)室對(duì)果蠅腦腫瘤（BRAT）的RNA結(jié)合活性表征驗(yàn)證了以上方法。該蛋白質(zhì)不曾參與RNA結(jié)合。X射線晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，NHL結(jié)構(gòu)域是一種新型的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。他們希望未來能確定其他RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
RNA特異性堿基修飾途徑的研究
RNA堿基修飾的研究由來已久，但直到最近才發(fā)現(xiàn)這種修飾也存在于mRNA，而且修飾的類型和程度會(huì)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。然而，RNA堿基修飾的基本機(jī)制依然有待了解。m6A甲基化作為一種特定的RNA堿基修飾，Mesiter實(shí)驗(yàn)室致力于破譯m6A甲基化途徑在編碼RNA和非編碼RNA調(diào)控中的作用，目前已經(jīng)鑒定了此種修飾的轉(zhuǎn)移酶(writers)、甲基化閱讀蛋白(readers) 和去甲基化酶(erasers)。但是，關(guān)于特定蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成以及這些因子的原子結(jié)構(gòu)知之甚少。因此，該實(shí)驗(yàn)室的目標(biāo)是在功能和結(jié)構(gòu)上表征m6A甲基化途徑的已知和推測(cè)的新因子，并在人類細(xì)胞中進(jìn)行鑒定。
最近，該實(shí)驗(yàn)室還在mRNA分子上鑒定了其他堿基修飾，包括5-甲基胞嘧啶或偽尿（嘧啶核）苷，并且已經(jīng)表明這種修飾也影響靶RNA的功能。同樣，更多已知的化學(xué)RNA修飾也可能會(huì)遺留在mRNA上，但是由于缺乏試劑至今尚未被發(fā)現(xiàn)。因此，Meister計(jì)劃創(chuàng)建此類工具。首先，他們會(huì)開發(fā)針對(duì)多種已知堿基修飾的單克隆抗體，用于表征攜帶此類修飾的RNA。然后，他們計(jì)劃研究METTL蛋白家族迄今未被表征的推定RNA甲基轉(zhuǎn)移酶。利用同源性搜索和結(jié)構(gòu)建模，他們發(fā)現(xiàn)這些蛋白可以分組（例如METTL2A / B，6和8），而且這些蛋白質(zhì)可能在功能上相關(guān)并且具有相似的RNA靶標(biāo)。發(fā)生相互作用的RNA和蛋白質(zhì)會(huì)通過生化方法識(shí)別。最后，他們還會(huì)使用X射線晶體學(xué)從結(jié)構(gòu)上研究這些蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。此項(xiàng)研究計(jì)劃可以幫助更好地理解RNA修飾介導(dǎo)的復(fù)雜調(diào)控。
部分已發(fā)表文章??
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