反義寡核苷酸（ASOs）是一種短的、化學(xué)合成的單鏈寡核苷酸，通過對其骨架和糖基進(jìn)行修飾，可增加其穩(wěn)定性、藥理特性以及與靶標(biāo)的結(jié)合，并通常具有較小的毒性。常用于細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)基因功能研究以及ASO核酸藥物的開發(fā)等。
ASO骨架和糖基常用的化學(xué)修飾
（Silva A C, et al. Brain, 2019.）
經(jīng)過化學(xué)修飾的ASOs可以通過多種作用機(jī)制發(fā)揮作用。例如，常見的是可以通過堿基互補(bǔ)配對與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，導(dǎo)致核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本敲低，從而降低有害蛋白的水平；也可以通過空間阻斷剪接因子來改變pre-mRNA剪接；或者通過阻止核糖體募集來阻斷mRNA翻譯。此外，將ASO設(shè)計(jì)成可以與疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的非編碼RNAs或毒性RNAs結(jié)合的反義分子，能夠大大擴(kuò)展可選擇靶標(biāo)的數(shù)量和類型。
根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)、結(jié)合序列和靶標(biāo)，單鏈ASOs可以通過以下幾種不同的作用機(jī)制（Rinaldi C and Wood M J A, 2018.）調(diào)節(jié)基因表達(dá)或改變pre-mRNA剪接。
反義寡核苷酸（ASOs）一旦與RNA結(jié)合，就會(huì)形成RNA-DNA雜合體，成為RNase H的底物，從而導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA的降解。研究表明，ASO的活性與RNase H水平有關(guān)，且RNase H依賴的ASO活性在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均存在。考慮到細(xì)胞核中RNase H的水平較高，因此，核內(nèi)靶標(biāo)mRNAs的降解率要高于胞質(zhì)（Vickers and Crooke, 2015）。
靶向AUG起始位點(diǎn)的ASOs可以在空間上阻斷RNA結(jié)合蛋白復(fù)合物（如核糖體亞基）的結(jié)合，從而抑制靶標(biāo)mRNA的翻譯。
在由毒性RNA功能獲得機(jī)制引起的疾病中，ASOs被設(shè)計(jì)成與非編碼區(qū)的高親和力互補(bǔ)結(jié)合，可以通過空間位阻阻止RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合和隔離。
ASO結(jié)合到內(nèi)含子-外顯子連接點(diǎn)可破壞剪接位點(diǎn)的穩(wěn)定性，或置換或募集剪接因子，從而導(dǎo)致靶標(biāo)外顯子的跳讀或內(nèi)含。
上游開放閱讀框（uORFs）的翻譯通常會(huì)抑制主開放閱讀框（pORF）的表達(dá)。ASOs與uORFs結(jié)合能夠增加下游ORF翻譯的蛋白量。
銳博生物采用國際一流的寡核酸合成和修飾技術(shù)，可針對lncRNA/circRNA/mRNA不同序列設(shè)計(jì)高特異性ASO序列，所合成的ASO序列是經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的單鏈RNA&DNA雜合體，極大地提高了其在細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)的穩(wěn)定性，可同時(shí)干擾胞質(zhì)和核內(nèi)的靶標(biāo)RNA，亦可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。并且相對病毒載體，合成周期短，適于后續(xù)ASO核酸藥的研發(fā)。
銳博生物ASO產(chǎn)品已被廣大客戶所認(rèn)可與使用，相關(guān)研究成果也已發(fā)表在諸如Cell Research、Nature structural & molecular biology、Molecular Cancer、Nature Metabolism、PNAS等國際知名期刊。研究模型涵蓋腫瘤發(fā)生、骨生成、乳腺癌轉(zhuǎn)移、成肌分化和肌肉再生、circRNA/lncRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、肝細(xì)胞癌、上皮性卵巢癌、卵巢癌化學(xué)耐藥等。
今天，小編給大家分享一篇復(fù)旦大學(xué)腫瘤研究所吳炅課題組&黃勝林課題組近期在Molecular Cancer (IF10.679)期刊上發(fā)表的題為LINC02273 drives breast cancer metastasis by epigenetically increasing AGR2 transcription的研究論文，該研究揭示了lncRNA通過表觀遺傳增加AGR2轉(zhuǎn)錄來驅(qū)動(dòng)乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。而使用動(dòng)物用ASO 靶向LINC02273能夠顯著抑制體內(nèi)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，這對于開發(fā)ASO核酸藥物用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌具有重要的指導(dǎo)意義。（該研究使用到的細(xì)胞/動(dòng)物用ASO由銳博生物提供）
首先，研究人員對乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和原發(fā)性腫瘤進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定了一個(gè)新的lncRNA LINC02273在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶中過表達(dá)，其位于人類染色體4q31.3內(nèi)。RACE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LINC02273有兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄本，長度分別為1653-nt和1252-nt，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本具有共同的轉(zhuǎn)錄起始站點(diǎn)，但是1653-nt轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平顯著高于1252-nt。因此接下來的機(jī)制研究中，研究人員重點(diǎn)關(guān)注了LINC02273的1653-nt轉(zhuǎn)錄本。RNA-ISH和亞細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)顯示LINC02273主要位于細(xì)胞核。
隨后，對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床樣本進(jìn)行了qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)LINC02273在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和晚期轉(zhuǎn)移癌患者的腫瘤中高表達(dá)。Kaplan–Meier生存分析顯示高表達(dá)LINC02273與較差的無復(fù)發(fā)生存率(RFS)相關(guān)。
接下來，通過CRISPR-cas9將LINC02273敲除，結(jié)果顯示LINC02273的缺失顯著降低了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而過表達(dá)LINC02273則進(jìn)一步增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，體內(nèi)敲除LINC02273時(shí)，移植瘤的生長速度被顯著抑制，腫瘤體積顯著減小，肺轉(zhuǎn)移明顯減少。表明LINC02273在體內(nèi)外均可促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。
那么，LINC02273是如何促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的呢？RNA pull-down、免疫印跡、RIP實(shí)驗(yàn)顯示LINC02273在乳腺癌細(xì)胞中與hnRNPL特異性相互作用。并且發(fā)現(xiàn)LINC02273的S3-2區(qū)域內(nèi)的CA重復(fù)序列和hnRNPL的RRM1/2基序?qū)τ贚INC02273和hnRNPL的相互作用是必需的。此外，當(dāng)用放線菌素D阻斷RNA轉(zhuǎn)錄時(shí)，hnRNPL的缺失使得LINC02273的半衰期明顯縮短，且穩(wěn)定性明顯降低。表明hnRNPL結(jié)合到其S3-2區(qū)域內(nèi)的CA-重復(fù)序列，可以提高LINC02273的穩(wěn)定性。
研究發(fā)現(xiàn)hnRNPL在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中的水平升高，敲低或過表達(dá)hnRNPL可抑制或增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，揭示hnRNPL在乳腺癌中具有促轉(zhuǎn)移作用?？紤]到hnRNPL對LINC02273穩(wěn)定性的影響，研究人員推測hnRNPL可能通過穩(wěn)定LINC02273來發(fā)揮其病理作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一猜想，說明LINC02273在介導(dǎo)hnRNPL的促轉(zhuǎn)移中具有重要作用。
接著，研究人員對LINC02273促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)行了探索。通過RNA-seq、ChIRP-seq以及qPCR鑒定了182個(gè)LINC02273潛在的直接下游靶標(biāo)，這些基因與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)LINC02273與AGR2和GUCY2C的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，這表明LINC02273對這些基因的轉(zhuǎn)錄具有潛在的調(diào)控作用。測序分析顯示AGR2在LINC02273缺失細(xì)胞中的水平明顯降低，且LIN02273結(jié)合于AGR2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上游1756-2150 bp。進(jìn)一步的ChIP-seq發(fā)現(xiàn)LINC02273的敲除會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活組蛋白H3K27ac和H3K4me3的降低。表明LINC02273結(jié)合AGR2啟動(dòng)子區(qū)，至少部分通過增強(qiáng)染色質(zhì)H3K4me3和H3K27ac修飾來促進(jìn)AGR2的轉(zhuǎn)錄激活。
由于hnRNPL可以穩(wěn)定LINC02273，那么hnRNPL是否通過LINC02273來調(diào)節(jié)AGR2？結(jié)果發(fā)現(xiàn)hnRNPL的下調(diào)顯著降低了AGR2的表達(dá)，支持了AGR2受hnRNPL調(diào)控的觀點(diǎn)。隨后，在LINC02273敲除細(xì)胞中過表達(dá)LINC02273可恢復(fù)AGR2表達(dá)的下降，而過表達(dá)hnRNPL則不能。此外，LINC02273過表達(dá)后，即使在hnRNPL表達(dá)降低的細(xì)胞中，AGR2的轉(zhuǎn)錄也升高。然而，LINC02273可能需要hnRNPL來充分激活A(yù)GR2轉(zhuǎn)錄。表明hnRNPL和LINC02273協(xié)同上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中AGR2的轉(zhuǎn)錄。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)/敲低hnRNPL顯著增加/降低了AGR2啟動(dòng)子區(qū)H3K4me3和H3K27ac修飾，但在LINC02273敲除細(xì)胞中hnRNPL不能增加H3K4me3或H3K27ac的修飾，說明hnRNPL對AGR2啟動(dòng)子的表觀遺傳調(diào)控依賴于LINC02273。有趣的是，在hnRNPL缺失的細(xì)胞中也沒有觀察到LINC02273過表達(dá)導(dǎo)致的H3K4me3和H3K27ac水平的升高。表明LINC02273和hnRNPL可以協(xié)同上調(diào)AGR2啟動(dòng)子區(qū)H3K27ac和H3K4me3水平，從而增強(qiáng)AGR2的表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移增加。
緊接著，研究人員對606例侵襲性乳腺癌患者的原始樣本中hnRNPL、LINC02273和AGR2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)LINC02273與AGR2和hnRNPL呈正相關(guān)。同時(shí)，hnRNPL與AGR2也呈正相關(guān)。此外，AGR2的高表達(dá)與RFS較差有關(guān)。LINC02273和AGR2低表達(dá)患者的生存獲益(RFS)更為顯著。上述結(jié)果有力地支持了LINC02273高表達(dá)與乳腺癌中較差的RFS相關(guān)，并且在hnRNPL-LINC02273軸下游AGR2表達(dá)的增加可能促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。
最后，由于反義寡核苷酸（ASO）藥物可靶向多種RNAs而受到越來越多的關(guān)注，并在體內(nèi)外得到了驗(yàn)證。因此，研究人員針對LINC02273設(shè)計(jì)了3個(gè)ASOs，以探討LINC02273是否可能被ASO干擾。體外實(shí)驗(yàn)顯示LINC02273 mRNA的表達(dá)可被ASO顯著抑制，乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力也受到損害。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過尾靜脈注射將10nmol ASO注射進(jìn)NOD/SCID小鼠體內(nèi)，每周2次。結(jié)果顯示腫瘤生長明顯下降、肺轉(zhuǎn)移灶明顯減少、腫瘤組織中LINC02273和AGR2 mRNA的表達(dá)水平降低。表明以ASO靶向LINC02273可能是一種減輕乳腺癌轉(zhuǎn)移的有效治療方法。
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