DNA和蛋白質(zhì)是生物中兩個(gè)最重要的生物大分子，它們之間的相互作用在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。那么，它們之間相互作用是如何進(jìn)行的呢？相互作用所涉及的結(jié)合或者切割所需的特定靶向位點(diǎn)（Motif）會(huì)是什么序列？研究人員又是通過(guò)哪些技術(shù)來(lái)探測(cè)的？由于基因組中98%的序列是非蛋白編碼區(qū)，高通量大規(guī)模地來(lái)尋找所有可能的蛋白靶向位點(diǎn)是技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

2020年7月31日，國(guó)際著名期刊Science Advances雜志在線(xiàn)發(fā)表了深圳華大生命科學(xué)研究院的題為“DNB-based on-chip motif finding (DocMF): A high-throughput method to profile different types of protein-DNA interactions”（DocMF: 一種基于DNA納米球技術(shù)的在芯片上高通量鑒定不同蛋白-DNA互作位點(diǎn)的平臺(tái)）的研究論文。

△Science Advances網(wǎng)站截圖

這是一個(gè)以DNA納米球（DNBSEQ^TM）技術(shù)為基礎(chǔ)的，使用高通量測(cè)序芯片來(lái)分析蛋白質(zhì)-DNA相互作用的高靈敏度、高通量的鑒定平臺(tái)（簡(jiǎn)稱(chēng)DocMF）。使用該系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)成功地鑒定了常用核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)（restriction sites），以及CRISPR/Cas蛋白特異性識(shí)別所需的PAM序列。

目前研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的靶向序列的方法有很多，常用的有微陣列技術(shù)（PBM：Protein-Binding Microarray）或者SELEX，但是這些方法通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力且通量不夠高。與這些技術(shù)相比，DocMF除了能檢測(cè)出更多的蛋白和DNA結(jié)合位點(diǎn)，還能在DNA分子被蛋白切割后，大規(guī)模地提供有關(guān)與蛋白質(zhì)相互作用的Motif信息。因此，DocMF是目前第一個(gè)能夠同時(shí)鑒定蛋白切割位點(diǎn)以及蛋白與DNA靶向結(jié)合位點(diǎn)的高通量平臺(tái)。

DocMF利用華大智造獨(dú)有的DNBSEQ^TM測(cè)序技術(shù)和兩次成像拍照結(jié)合的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)-DNA相互作用中所涉及的切割或者結(jié)合所需的特異性靶向序列。從單個(gè)DNB的序列信息和熒光信號(hào)變化，我們可以找到與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的所有序列，并通過(guò)生物信息學(xué)分析確定特定的靶向序列。測(cè)序芯片的通量可以允許一次性篩選十億級(jí)別、帶著不同序列的DNA納米球，大大高于PBM或者SELEX的通量，DocMF能夠很靈敏地找到弱結(jié)合力的所有互作位點(diǎn)序列。

△DocMF流程示意圖

運(yùn)用DocMF方法，研究人員首先鑒定了不同類(lèi)型的限制性?xún)?nèi)切核酸酶以及CRISPR/Cas的識(shí)別位點(diǎn)。最新基因編輯工具CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于多數(shù)細(xì)菌和古菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，經(jīng)生物學(xué)家改造后，可高效、便捷地實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)修飾。此類(lèi)Cas系統(tǒng)包含三個(gè)核心元件-Cas核酸酶，引導(dǎo)RNA（gRNA），間隔序列前體臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM序列對(duì)Cas蛋白特異性識(shí)別靶序列至關(guān)重要,也是CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)揮功效的關(guān)鍵特性之一。目前，現(xiàn)有的技術(shù)（E.coli雙抗實(shí)驗(yàn)，Cas核酸酶切后高通量測(cè)序等），對(duì)PAM序列的鑒定仍存在不同的缺陷，如耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低等。利用DocMF，研究人員發(fā)現(xiàn)SpCas9除了經(jīng)典的5’-NGG-3’的PAM外，還有兩個(gè)較為少見(jiàn)的5’-NAG-3’和5’-NGA-3’的PAM序列，并且算出NAG出現(xiàn)幾率在5%左右，而更弱結(jié)合力的NGA只有1.6%。

文章還探索了兩個(gè)未發(fā)表的新型CRSIPR/Cas蛋白，VeCas9和BvCas12a。其中VeCas9的PAM序列用傳統(tǒng)的E.coli雙抗實(shí)驗(yàn)方法無(wú)法準(zhǔn)確鑒定出。利用DocMF，這兩個(gè)新型CRISPR/Cas蛋白的寬松PAM序列也均能被準(zhǔn)確檢出。同時(shí)研究人員還能根據(jù)芯片上信號(hào)變化比值，對(duì)不同PAM序列的活性排序，找出結(jié)合力最強(qiáng)的PAM序列，有助于設(shè)計(jì)體內(nèi)基因編輯的最佳靶向位點(diǎn)。同時(shí)文章作者也討論說(shuō)明DocMF還可以被用來(lái)尋找Cas蛋白的脫靶序列。因此，DocMF為新型基因編輯系統(tǒng)的研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，將會(huì)更快地推進(jìn)更多新型編輯系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及其功能研究。

△經(jīng)DocMF鑒定出的VeCas9和BvCpf1的PAM序列

為研究蛋白與DNA結(jié)合靶向位點(diǎn)的鑒定，團(tuán)隊(duì)選用無(wú)切割活性的dCas9進(jìn)行測(cè)試，篩選出NGG序列為dCas9的PAM特異性位點(diǎn)，該特異性NGG序列是與以前的報(bào)道一致的。同時(shí)研究人員也發(fā)現(xiàn)，由于蛋白上兩個(gè)氨基酸的突變，導(dǎo)致dCas9無(wú)法像傳統(tǒng)的Cas9一樣對(duì)NAG和NGA序列進(jìn)行靶向結(jié)合。

△DocMF平臺(tái)鑒定的dCas9結(jié)合位點(diǎn)

綜上，DocMF平臺(tái)基于華大智造測(cè)序儀，提供了一種檢測(cè)多種蛋白質(zhì)-DNA互作靶向位點(diǎn)的高通量的方法。整個(gè)鑒定流程耗時(shí)約三天，包括文庫(kù)的制備、測(cè)序及分析，極大的縮減了工作時(shí)間及工作量。由于其高深度和高通量，也極大地提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

文章通訊作者之一、華大研究院院長(zhǎng)徐訊表示，DocMF不只是全球唯一的能兼容鑒定蛋白與DNA結(jié)合或切割靶向位點(diǎn)的高通量平臺(tái)，也具有鑒定CRISPR系統(tǒng)脫靶位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的潛力。DocMF平臺(tái)的開(kāi)發(fā)，為后續(xù)蛋白質(zhì)-DNA互作的研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，同時(shí)此研究也擴(kuò)展了以DNA納米球?yàn)榛A(chǔ)的測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用范圍，體現(xiàn)了國(guó)產(chǎn)化基因測(cè)序平臺(tái)研究工具的優(yōu)勢(shì)。