2020年11月24日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧研究組在Cell Discovery雜志發(fā)表題為“Structural insight into the assembly and conformational activation of human origin recognition complex”的研究論文，報(bào)道了人源DNA復(fù)制起始復(fù)合物ORC組裝過程中兩個(gè)關(guān)鍵復(fù)合物ORC2-5和ORC1-5的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)上部分闡釋了人源復(fù)制起點(diǎn)識別復(fù)合物ORC的分步組裝和逐步激活的分子機(jī)制。

真核生物DNA復(fù)制包含有一個(gè)復(fù)雜的復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制，以保證在一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)基因組僅復(fù)制一次。復(fù)制起始的第一步是由ORC（由ORC1-6六個(gè)亞基組成）識別并標(biāo)記DNA復(fù)制起始位點(diǎn)，然后招募復(fù)制解旋酶，組裝成復(fù)制體。ORC的功能紊亂與一些人類疾病直接相關(guān)，ORC亞基的突變與罕見遺傳發(fā)育疾病MGS（Meier-Gorlin syndrome）直接相關(guān)。MGS患者在胚胎期生長遲緩并伴隨多種發(fā)育畸形，出生后發(fā)育也嚴(yán)重受阻并導(dǎo)致身材矮小、小耳癥和膝蓋骨缺失等癥狀。此外，一些致病性DNA病毒（如人類皰疹病毒）需要劫持人源DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制，它們通過招募ORC到病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)實(shí)現(xiàn)這一過程。

在釀酒酵母中，ORC結(jié)合到DNA以后，在細(xì)胞周期的不同階段中，始終以六聚體形式穩(wěn)定結(jié)合。2018年，高寧教授與合作者BikKwoonTye教授和翟元樑博士以結(jié)構(gòu)研究為基礎(chǔ)，闡釋了釀酒酵母ORC特異性識別DNA復(fù)制起點(diǎn)的分子機(jī)制（Nature, 2018）。人源ORC有著更為復(fù)雜的功能調(diào)控機(jī)制：ORC2-5四個(gè)亞基形成一個(gè)相對穩(wěn)定的核心復(fù)合物，ORC復(fù)合物組裝到DNA上依賴于ORC1，ORC1自身的蛋白水平以及ORC1與ORC2-5的結(jié)合或解離都受到細(xì)胞周期的調(diào)控。目前尚不清楚人源ORC復(fù)合物分步組裝到DNA復(fù)制起點(diǎn)的機(jī)制。

為了探索人源ORC的組裝過程和功能激活機(jī)制，高寧組解析了ORC2-5和ORC1-5兩種復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)（圖1）。ORC2-5結(jié)構(gòu)中，ORC2-WHD結(jié)構(gòu)域插入到ORC與DNA結(jié)合的中央孔道內(nèi)，從而阻擋了DNA的進(jìn)入，很好地解釋了ORC2-5功能自抑制的分子機(jī)理。ORC1-5中只有ORC1-WHD穩(wěn)定結(jié)合到了ORC2-5復(fù)合物上，ORC1-AAA+尚未完全穩(wěn)定，存在多種構(gòu)象狀態(tài)。一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是ORC1-5存在兩種主要的結(jié)構(gòu)狀態(tài)：State I 與ORC2-5的結(jié)構(gòu)大致相同，也處于一種自抑制的構(gòu)象；在State II中，ORC2-WHD向中央孔道外旋轉(zhuǎn)了120度，部分暴露了位于復(fù)合物中央的DNA結(jié)合通道，表明State II是一種部分解除抑制效應(yīng)的構(gòu)象。這些結(jié)果從結(jié)構(gòu)層面上詮釋了ORC1在ORC功能激活中的重要角色：ORC1結(jié)合到ORC2-5復(fù)合物上可以促進(jìn)ORC2-WHD的構(gòu)象變化，從抑制狀態(tài)向激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變，同時(shí)ORC1-AAA+結(jié)構(gòu)域保持高度動(dòng)態(tài)，以促進(jìn)DNA進(jìn)入ORC的中央通道。

圖1.人源ORC2-5和ORC1-5的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

結(jié)合以往的研究結(jié)果，這篇工作進(jìn)一步完善了人源ORC組裝到復(fù)制起點(diǎn)的模型（圖2）：ORC1首先通過特有的BAH結(jié)構(gòu)域結(jié)合到攜帶有特定修飾的核小體上，隨后招募ORC2-5核心復(fù)合物，形成ORC1-5復(fù)合物。通過一系列的構(gòu)象激活，例如ORC2-WHD結(jié)構(gòu)域的旋轉(zhuǎn)，染色質(zhì)DNA進(jìn)入到ORC1-5復(fù)合物的中央孔道。伴隨著后續(xù)的CDC6及ORC6的結(jié)合，激活的ORC進(jìn)一步招募復(fù)制解旋酶從而完成Pre-replicationcomplex的組裝。

圖2.人源ORC逐步組裝到復(fù)制起點(diǎn)的模型

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、生命科學(xué)聯(lián)合中心高寧教授和高寧組李寧寧副研究員為本文的共同通訊作者。高寧組2016級博士生程稼萱和李寧寧為共同第一作者。香港大學(xué)翟元樑研究員和北京大學(xué)胡家志研究員為本課題提供了重要的指導(dǎo)與幫助。本課題受到了國家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科技部的項(xiàng)目資助，以及北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)、電鏡實(shí)驗(yàn)室、高性能計(jì)算平臺(tái)、生命科學(xué)聯(lián)合中心、生科院儀器中心、膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的支持。

編輯：李麗

來源：北京大學(xué)