2020年11月24日，北京大學生命科學學院高寧研究組在Cell Discovery雜志發(fā)表題為“Structural insight into the assembly and conformational activation of human origin recognition complex”的研究論文，報道了人源DNA復制起始復合物ORC組裝過程中兩個關鍵復合物ORC2-5和ORC1-5的冷凍電鏡結構，從結構上部分闡釋了人源復制起點識別復合物ORC的分步組裝和逐步激活的分子機制。

真核生物DNA復制包含有一個復雜的復制起始調控機制，以保證在一個細胞周期內基因組僅復制一次。復制起始的第一步是由ORC（由ORC1-6六個亞基組成）識別并標記DNA復制起始位點，然后招募復制解旋酶，組裝成復制體。ORC的功能紊亂與一些人類疾病直接相關，ORC亞基的突變與罕見遺傳發(fā)育疾病MGS（Meier-Gorlin syndrome）直接相關。MGS患者在胚胎期生長遲緩并伴隨多種發(fā)育畸形，出生后發(fā)育也嚴重受阻并導致身材矮小、小耳癥和膝蓋骨缺失等癥狀。此外，一些致病性DNA病毒（如人類皰疹病毒）需要劫持人源DNA復制系統(tǒng)進行病毒基因組的復制，它們通過招募ORC到病毒DNA復制起點實現這一過程。

在釀酒酵母中，ORC結合到DNA以后，在細胞周期的不同階段中，始終以六聚體形式穩(wěn)定結合。2018年，高寧教授與合作者BikKwoonTye教授和翟元樑博士以結構研究為基礎，闡釋了釀酒酵母ORC特異性識別DNA復制起點的分子機制（Nature, 2018）。人源ORC有著更為復雜的功能調控機制：ORC2-5四個亞基形成一個相對穩(wěn)定的核心復合物，ORC復合物組裝到DNA上依賴于ORC1，ORC1自身的蛋白水平以及ORC1與ORC2-5的結合或解離都受到細胞周期的調控。目前尚不清楚人源ORC復合物分步組裝到DNA復制起點的機制。

為了探索人源ORC的組裝過程和功能激活機制，高寧組解析了ORC2-5和ORC1-5兩種復合物的電鏡結構（圖1）。ORC2-5結構中，ORC2-WHD結構域插入到ORC與DNA結合的中央孔道內，從而阻擋了DNA的進入，很好地解釋了ORC2-5功能自抑制的分子機理。ORC1-5中只有ORC1-WHD穩(wěn)定結合到了ORC2-5復合物上，ORC1-AAA+尚未完全穩(wěn)定，存在多種構象狀態(tài)。一個重要的發(fā)現是ORC1-5存在兩種主要的結構狀態(tài)：State I 與ORC2-5的結構大致相同，也處于一種自抑制的構象；在State II中，ORC2-WHD向中央孔道外旋轉了120度，部分暴露了位于復合物中央的DNA結合通道，表明State II是一種部分解除抑制效應的構象。這些結果從結構層面上詮釋了ORC1在ORC功能激活中的重要角色：ORC1結合到ORC2-5復合物上可以促進ORC2-WHD的構象變化，從抑制狀態(tài)向激活狀態(tài)轉變，同時ORC1-AAA+結構域保持高度動態(tài)，以促進DNA進入ORC的中央通道。

圖1.人源ORC2-5和ORC1-5的冷凍電鏡結構

結合以往的研究結果，這篇工作進一步完善了人源ORC組裝到復制起點的模型（圖2）：ORC1首先通過特有的BAH結構域結合到攜帶有特定修飾的核小體上，隨后招募ORC2-5核心復合物，形成ORC1-5復合物。通過一系列的構象激活，例如ORC2-WHD結構域的旋轉，染色質DNA進入到ORC1-5復合物的中央孔道。伴隨著后續(xù)的CDC6及ORC6的結合，激活的ORC進一步招募復制解旋酶從而完成Pre-replicationcomplex的組裝。

圖2.人源ORC逐步組裝到復制起點的模型

北京大學生命科學學院、生命科學聯(lián)合中心高寧教授和高寧組李寧寧副研究員為本文的共同通訊作者。高寧組2016級博士生程稼萱和李寧寧為共同第一作者。香港大學翟元樑研究員和北京大學胡家志研究員為本課題提供了重要的指導與幫助。本課題受到了國家自然科學基金委員會、科技部的項目資助，以及北京大學冷凍電鏡平臺、電鏡實驗室、高性能計算平臺、生命科學聯(lián)合中心、生科院儀器中心、膜生物學國家重點實驗室的支持。

編輯：李麗

來源：北京大學