CRISPR/Cas13是一類RNA介導(dǎo)的靶向RNA切割的系統(tǒng)，它被廣泛地應(yīng)用于RNA敲低、RNA單堿基編輯、RNA定點(diǎn)修飾、RNA活細(xì)胞示蹤及核酸檢測領(lǐng)域。相比于傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)，Cas13系統(tǒng)具有更高的敲低效率和特異性；相比于Cas9介導(dǎo)的DNA編輯技術(shù)，Cas13不會對基因組造成永久性改變，甚至可通過藥物來調(diào)控RNA編輯，使其具有可逆性，因此在疾病治療上具有比較獨(dú)特的優(yōu)勢。2015年，美國Eugene Koonin實(shí)驗(yàn)室和張鋒團(tuán)隊(duì)合作，利用計(jì)算生物學(xué)方法在微生物宏基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了Cas13a(c2c2)、Cas13b(c2c6)和Cas13c(c2c7)三種系統(tǒng)，并證明了這些系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中可對靶RNA進(jìn)行高效地敲低。張鋒團(tuán)隊(duì)對Cas13和RNA脫氨酶ADAR2進(jìn)行改造，將其應(yīng)用于哺乳動物的RNA單堿基編輯。2018年，張鋒的學(xué)生畢業(yè)后報(bào)道了Cas13d系統(tǒng)，相對于之前的系統(tǒng)，Cas13d蛋白減少了100到200個(gè)氨基酸。其中，RfxCas13d展現(xiàn)出最佳的敲低效率，加上體積小的優(yōu)勢使其受到領(lǐng)域內(nèi)科研人員的追捧。雖然RfxCas13d只有967個(gè)氨基酸，但整個(gè)系統(tǒng)已接近單個(gè)AAV的裝載極限，而基于Cas13d的RNA單堿基編輯工具則更難用單個(gè)腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）載體進(jìn)行遞送，因此，開發(fā)出更小的、高效的RNA編輯工具對臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。

5月3日，Nature Methods在線發(fā)表了題為《利用未獲培養(yǎng)的自然微生物中發(fā)現(xiàn)新型緊湊型CRISPR-Cas13系統(tǒng)進(jìn)行可編程RNA編輯》的研究論文。該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員楊輝課題組和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院教授賴錦盛團(tuán)隊(duì)合作完成。研究人員通過對微生物大規(guī)模宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析，發(fā)現(xiàn)了兩類新的CRISPR/Cas13系統(tǒng)；通過功能實(shí)驗(yàn)和工程化改造，開發(fā)出一套高效率、高特異性的RNA編輯工具，該工具對開發(fā)基于RNA編輯的基因治療手段具有重要的促進(jìn)作用。

最近報(bào)道的Cas13系統(tǒng)是從可培養(yǎng)的微生物基因組數(shù)據(jù)中挖掘的，但自然界中90%的微生物都是不可培養(yǎng)的，因此，楊輝團(tuán)隊(duì)把目標(biāo)聚焦在挖掘未獲培養(yǎng)的自然微生物宏基因組數(shù)據(jù)。該研究通過計(jì)算生物學(xué)算法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，鑒定到兩個(gè)新的Cas13家族，并命名為Cas13X和Cas13Y。其中，Cas13X.1蛋白比常用的RfxCas13d蛋白要小將近200個(gè)氨基酸，為目前最小的Cas13蛋白。通過對大量內(nèi)源基因位點(diǎn)進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)，Cas13X.1展現(xiàn)出和RfxCas13d一樣的高活性和高特異性。為進(jìn)一步研究Cas13X.1在抗RNA病毒方面的應(yīng)用潛力，研究人員分別對H1N1病毒和過表達(dá)的部分新冠病毒基因組上多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行靶向切割，發(fā)現(xiàn)Cas13X.1在體外展現(xiàn)出良好的病毒抑制效果。最后，楊輝團(tuán)隊(duì)將突變的Cas13X.1與ADAR2dd進(jìn)行融合，并進(jìn)行了一系列蛋白截短改造，開發(fā)出一種迷你型的RNA單堿基編輯工具，通過與之前報(bào)道的RNA單堿基編輯系統(tǒng)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，基于迷你型Cas13X.1蛋白的RNA單堿基編輯系統(tǒng)（miniCas13X-ADAR2dd）可對靶RNA進(jìn)行高效的A到I和C到U的編輯。同時(shí)，miniCas13X-ADAR2dd比REPAIR和RESCUE系統(tǒng)小將近900aa，可包裝到一個(gè)AAV里面。此外，全轉(zhuǎn)錄組分析顯示，迷你堿基編輯器脫靶活性極低，是一項(xiàng)高保真的堿基編輯技術(shù)。

值得一提的是，目前Cas13系統(tǒng)應(yīng)用于臨床最大的障礙是Cas13蛋白本身的旁切活性（collateral activity，靶RNA激活的非靶標(biāo)RNA切割活性）。已有證據(jù)表明，Cas13d的旁切活性會對動物細(xì)胞和個(gè)體產(chǎn)生一定的毒副作用。雖然Cas13X.1在體外切割實(shí)驗(yàn)中顯示出比Cas13a和Cas13d更低的旁切活性，但Cas13X.1的進(jìn)一步改進(jìn)和體內(nèi)的長期安全性評價(jià)對Cas13X.1的最終臨床應(yīng)用具有重要意義。

該研究從未獲培養(yǎng)微生物宏基因組數(shù)據(jù)中鑒定到兩個(gè)新的Cas13系統(tǒng)，豐富了Cas13家族的多樣性；通過大量實(shí)驗(yàn)證明了Cas13X.1在RNA編輯方面具有應(yīng)用潛力，小尺寸很好地解決了Cas13體內(nèi)遞送的問題，有望在未來成為一種高效安全的RNA治療方法，為疾?。ㄓ绕涫呛币姴。┑幕蛑委熖峁└噙x擇。

該研究由腦智卓越中心博士后胥春龍和周英思、博士研究生肖慶全、博士后賀冰冰和耿冠男等在楊輝、周英思和賴錦盛的指導(dǎo)下完成。楊輝課題組的博士后汪子康和董雪、研究生曹碧蓉和本科生王一凡等其他成員積極參與了該研究。研究工作得到腦智卓越中心流式分選和高性能計(jì)算集群平臺的協(xié)助，獲得科學(xué)技術(shù)部、國家自然科學(xué)基金委、中科院、上海市的資助。

　　圖1.從未獲培養(yǎng)的自然微生物宏基因組數(shù)據(jù)挖掘新的Cas13蛋白應(yīng)用于哺乳動物與病毒RNA的敲降。a.構(gòu)建新挖掘的Cas13X, Cas13Y蛋白與前人報(bào)道的 Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d蛋白的進(jìn)化樹。括號展示了常見的Cas13蛋白及其大小。標(biāo)尺展示了大小為0.5的相對遺傳距離。b.Cas13X與Cas13Y相關(guān)CRISPR系統(tǒng)的基因座示意圖。藍(lán)色和綠色長方形分別表示Cas13和CRISPR重復(fù)單元?；疑庑伪硎鹃g隔序列。c.Cas13X.1介導(dǎo)高效的多重RNA敲降。d.上：SARS-CoV-2與SARS-CoV-1以及SARS-CoV-2與所有冠狀病毒基因組序列的比對結(jié)果；中：SARS-Cov-2病毒RNA敲降的報(bào)告系；下：病毒RNA敲降結(jié)果。

　　圖2.開發(fā)基于Cas13X.1的迷你型RNA堿基編輯器應(yīng)用于高效的A到I和C到U堿基替換。a.基于dCas13X.1的RNA腺苷酸編輯器xABE以及堿基編輯報(bào)告系統(tǒng)示意圖；b.預(yù)測的Cas13X.1與ADAR2dd蛋白結(jié)構(gòu)。黃色和綠色分別表示Cas13X.1的N端與C端，紅色代表HEPN基序，橙色表示ADAR2dd；c.xABE截短突變體的效率檢測結(jié)果。d.全長與迷你xABE及過去報(bào)道的ABE的A到I編輯效率的比較結(jié)果；e.全長與迷你xCBE及過去報(bào)道的CBE的C到U編輯效率的比較結(jié)果；f.迷你xABE/xCBE顯著降低全轉(zhuǎn)錄組的RNA脫靶編輯。

來源： 腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心