營養(yǎng)與健康所等開發(fā)出變形式堿基編輯新系統(tǒng)

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5月10日，Nature Cell Biology在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所研究員楊力課題組與合作者在堿基編輯研究領(lǐng)域發(fā)布的最新進展——Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations。

堿基編輯器（base editor）主要是由兩個主要的功能結(jié)構(gòu)域組分組成，分別為識別基因組特定DNA序列定位的定位器（locator）和可對該特定基因組DNA序列（或者位點）進行編輯的效應(yīng)器（effector）。其中，胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)主要以nCas9/sgRNA作為locater執(zhí)行對編輯的識別和定位功能，以胞嘧啶脫氨酶APOBEC/AID作為effector執(zhí)行胞嘧啶脫氨的功能并最終實現(xiàn)C-to-T的編輯。隨著堿基編輯技術(shù)的不斷開發(fā)，基因編輯效率和靶向范圍顯著提高，但在全基因組和/或全轉(zhuǎn)錄組水平仍存在大規(guī)模的脫靶效應(yīng)，這限制了其在生物學(xué)和臨床上的應(yīng)用。

該研究中，研究人員首先發(fā)現(xiàn)了在胞嘧啶脫氨酶中天然存在的抑制序列結(jié)構(gòu)域（deoxycytidine deaminase inhibitor，dCDI），并利用其開發(fā)出一系列可高效催化靶位點C-to-T編輯、抑制脫靶位點C-to-T編輯的新型堿基編輯系統(tǒng)，并依據(jù)其特性，命名為變形式堿基編輯系統(tǒng)（transformer base editors，簡稱tBEs）（圖A）。結(jié)合高通量測序技術(shù)和計算生物學(xué)的研究方法，研究人員評估了tBE的編輯效率、脫靶效應(yīng)和編輯產(chǎn)物純度，結(jié)果顯示，tBE堿基編輯系統(tǒng)可以在執(zhí)行高效C-to-T編輯的同時，最大程度地減少由locator產(chǎn)生的Cas9/sgRNA依賴性脫靶效應(yīng)（sgRNA-dependent off-target，OTsg）和effector產(chǎn)生的Cas9/sgRNA非依賴性單鏈DNA脫靶效應(yīng)（sgRNA-independent single-stranded off-target，OTss）。此外，該研究還構(gòu)建了在全基因組檢測脫靶的計算分析流程BEIDOU（Base/Prime Editor Induced DNA Off-target site identification Unified toolkit，https://github.com/YangLab/BEIDOU）（圖B），并結(jié)合全轉(zhuǎn)錄組RNA脫靶鑒定工具RADAR（RNA-editing Analysis-pipeline to Decode All twelve-types of RNA-editing events，https://github.com/YangLab/RADAR）（Wang et al. Cell Rep 2020），證明了tBE具有與本底水平類似的全基因組和全轉(zhuǎn)錄組突變效應(yīng)，提示tBE可能不具有早期BE3的脫靶效應(yīng)。另外，該研究成功地將tBE用于小鼠Pcsk9的編輯，通過引入終止密碼子的方法降低了小鼠體內(nèi)PCSK9的表達和LDL-C的水平。對編輯后小鼠進行全基因組和全轉(zhuǎn)錄組測序表明，tBE在in vivo水平同樣僅產(chǎn)生與背景水平相一致的突變率。相關(guān)研究證明了tBE堿基編輯系統(tǒng)具有很好的特異性和安全性，提高了堿基編輯系統(tǒng)的應(yīng)用價值，拓展了堿基編輯系統(tǒng)在點突變引起的疾病治療中的應(yīng)用前景。

楊力、上科大生命學(xué)院教授陳佳、武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院教授殷昊和上科大免疫化學(xué)研究所教授楊貝為論文的共同通訊作者。楊力組博士生薛尉，陳佳研究組博士王麗潔（畢業(yè)生）和博士生高潤澤、殷昊研究組博士后張紅霞和碩博研究生邱厚圓為論文的共同第一作者。研究工作得到科學(xué)技術(shù)部、國家自然科學(xué)基金委、武漢大學(xué)、武漢市科技局、中科院青年創(chuàng)新促進會、教育部和博士后基金等項目的資助。

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