全世界目前有超過四億的二型糖尿?。═2DM）患者，僅在2019年因為糖尿病及其并發(fā)癥而死亡的人數(shù)高達420萬。T2DM已成為威脅人類生命健康最為嚴(yán)重的慢性病之一，其主要臨床表現(xiàn)為胰島素抵抗、胰島功能耗竭。傳統(tǒng)T2DM治療藥物依然難以使部分患者血糖恢復(fù)正常，并且有造成低血糖、腹瀉、惡心、嘔吐等多種不良反應(yīng)的可能性。近年來，以間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）為代表的干細(xì)胞療法為治療糖尿病提供了新的手段和希望。然而，糖尿病患者體內(nèi)高血糖所產(chǎn)生的微環(huán)境壓力顯著抑制了干細(xì)胞MSCs在體內(nèi)的存活時間從而最終影響其治療效果。

為了增強MSCs針對T2DM的療效，清華大學(xué)杜亞楠研究團隊利用慢病毒感染體系對人脂肪來源的MSCs進行Exendin-4的基因修飾（MSC-Ex4），Exendin-4是胰高血糖素樣肽-1受體激動劑（GLP-1RAs）家族中的一員，已經(jīng)在臨床上批準(zhǔn)用于治療T2DM。然而Exendin-4作為只有39個氨基酸的多肽，極易被腎臟清除，在體內(nèi)半衰期只有半天。本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)注射MSC-Ex-4小鼠體內(nèi)Exendin-4濃度達峰時間可顯著延長，實現(xiàn)了Exendin-4的長效釋放。并且由于MSC內(nèi)源表達Extendin-4的受體GLP-1R，因此MSC-Ex-4可通過自分泌效應(yīng)增強自身在糖尿病高糖環(huán)境下的存活和療效，同時其分泌的其他活性因子可通過內(nèi)分泌作用保護胰腺β細(xì)胞，并通過旁分泌作用改善肝細(xì)胞胰島素敏感性，減少肝細(xì)胞脂質(zhì)積累（圖1）。

圖1. MSC-Ex-4的構(gòu)建示意圖，對胰腺和肝臟細(xì)胞的潛在作用機制和對T2DM的治療策略。（A）通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)構(gòu)建Exendin-4基因工程MSCs (MSC-Ex-4)，在不斷釋放Exendin-4的同時可對APOM、IGFBP2等蛋白因子分泌進行調(diào)節(jié)。其中，MSC-Ex-4分泌的Exendin-4可通過自分泌與自身的GLP-1R相互作用延長其在高糖應(yīng)激下的抗逆能力。同時MSC-Ex-4分泌的其他活性因子可通過內(nèi)分泌作用保護胰腺β細(xì)胞，通過旁分泌作用改善肝細(xì)胞胰島素敏感性，減少肝細(xì)胞脂質(zhì)積累。（B）多次系統(tǒng)性注射可以顯著改善二型糖尿病癥狀。通過注射3D明膠微支架輔助MSC-Ex-4作為細(xì)胞包封和給藥載體，單次局部給藥可實現(xiàn)長效治療效果。

MSC-Ex-4在模擬T2DM高糖環(huán)境的體外模型中表現(xiàn)出良好的抗逆能力。進一步研究證實，這種能力得益于MSC-Ex-4自分泌的Exenidn-4配體結(jié)合了自身表達的GLP-1R受體并激活下游的AMPK信號通路，從而促進了細(xì)胞增殖，并且顯著增強了抗凋亡及抵抗衰老能力。與此同時，MSC-Ex-4分泌的Exendin-4可促進胰島β細(xì)胞增殖，抑制其衰老和凋亡。進一步，通過對MSC-Ex-4的轉(zhuǎn)錄組和分泌組學(xué)進行分析，發(fā)現(xiàn)其分泌的大量生物活性因子(如IGFBP2、APOM等)也可通過旁分泌作用激活肝臟細(xì)胞PI3K-AKT信號通路從而改善肝臟胰島素敏感性并減少脂質(zhì)積累（圖2）。

圖2. MSC-Ex-4在高糖環(huán)境下抗凋亡和抗衰老能力增強，細(xì)胞內(nèi)AMPK信號通路被激活（A-C）。同時MSC-Ex-4可促進胰島細(xì)胞增殖和抑制凋亡（D-F），并通過分泌因子激活肝臟細(xì)胞PI3K-AKT信號通路（G-I）。

在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠T2DM模型中，通過追蹤尾靜脈注射后的MSCs，發(fā)現(xiàn)MSC-Ex-4在注射一周后的存活數(shù)量相較于未修飾對照組提高了40%。在一個月治療后，小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性都具有明顯改善，代謝活動能力顯著增強。并且高脂飲食所導(dǎo)致的脂肪肝病征也明顯緩解。通過對肝臟轉(zhuǎn)錄組測序分析，肝臟中糖脂代謝相關(guān)通路上調(diào)。而進一步研究人員從蛋白水平上驗證了AKT信號通路被激活，顯示該體內(nèi)存活率的提高和MSC-Ex-4內(nèi)分泌和旁分泌的雙重作用相關(guān)（圖3）。

圖3. MSC-Ex-4系統(tǒng)性注射治療示意圖（A）。MSC-Ex-4注射一周后在體存活數(shù)量增加（B），同時Exendin-4達峰時間顯著延長（C）。小鼠代謝表型顯著改善（D-G）。

最后，研究團隊利用3D多孔明膠微支架（微載體）對MSC-Ex-4細(xì)胞進行包裹和體內(nèi)遞送。該多孔微載體相關(guān)技術(shù)為課題組前期開發(fā)，可作為干細(xì)胞生長的微環(huán)境(microniche) 輔助高效干細(xì)胞治療， 并且由北京華龕生物科技有限公司進行了轉(zhuǎn)化和商品化， 相關(guān)明膠微載體產(chǎn)品分別獲批中國藥監(jiān)局首款細(xì)胞用藥用輔料資質(zhì)和美國FDA首款細(xì)胞用DMF藥用輔料資質(zhì)。，在此明膠微載體的輔助下，單劑量皮下注射可進一步延長MSC-Ex-4在體內(nèi)的存活時間至一個月。而血清胰島素、甘油三酯（TGs）水平以及葡萄糖耐量等指標(biāo)也顯示該微載體作為細(xì)胞藥劑可增強MSC-Ex-4治療效果達兩個月以上。這些發(fā)現(xiàn)為MSC-Ex-4和明膠微載體聯(lián)用改善包括糖尿病和代謝相關(guān)脂肪性肝?。∕AFLD）在內(nèi)的代謝功能障礙疾病以及其他相關(guān)并發(fā)癥(如糖尿病足，糖尿病嚴(yán)重下肢缺血等)提供了新的策略和方法（圖4）。

圖4. MSC-Ex-4聯(lián)合3D明膠微支架局部注射治療示意圖（A）。3D明膠微支架輔助遞送可延長MSC-Ex-4存活時間至一個月（B），治療效果至兩個月以上（D-E）。

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心杜亞楠教授為該論文通訊作者。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)聯(lián)合中心博士后張元元為本文第一作者，生命科學(xué)聯(lián)合中心博士生高爽為共同第一作者。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士生梁愷倪、博士生吳釗釗、武冰潔以及北京華龕生物科技公司劉偉、鄢曉君亦對本研究做出重要貢獻。本項目的研究得到了國家重點研發(fā)計劃（2017YFA0104901）、國家自然科學(xué)基金（82061148010）、北京市自然科學(xué)技術(shù)委員會（Z181100001818005）等多個項目的資助支持。

文章鏈接：https://advances.sciencemag.org/content/7/27/eabi4379

來源：清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院