單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)（scWGS）可以有效揭示生物樣品中不同細(xì)胞之間的異質(zhì)性，并系統(tǒng)鑒定單個細(xì)胞的基因組中發(fā)生的遺傳變化，例如拷貝數(shù)變異（CNV）和點突變（單核苷酸變異，SNV）等。過去十年，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種單細(xì)胞基因組擴增技術(shù)，例如簡并寡核苷酸引物PCR擴增技術(shù)(DOP-PCR)、多重置換擴增技術(shù)（MDA）、多重退火和基于環(huán)的擴增循環(huán)技術(shù)（MALBAC），以及通過轉(zhuǎn)座子插入和體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行線性擴增技術(shù)（LIANTI）等。但是，目前的單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)均基于二代測序（NGS）平臺，該平臺檢測準(zhǔn)確度高，但是測序讀長相對較短（通常只有150bpX2），主要適用于檢測單個細(xì)胞中的單核苷酸變異（SNV）、小的插入缺失（<50bp，Indel）以及拷貝數(shù)變異（CNV）等。由于二代測序平臺讀長的限制，對于基因組中結(jié)構(gòu)變異的檢測具有很大的局限性。結(jié)構(gòu)變異（包括插入、缺失、重復(fù)和易位等）是人類體細(xì)胞遺傳變異的主要來源之一，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有潛在的驅(qū)動作用，然而目前在單個細(xì)胞水平對基因組結(jié)構(gòu)變異的研究卻鮮有報道。

論文截圖

針對基于二代測序平臺的單細(xì)胞基因組測序技術(shù)難以高效鑒定單個細(xì)胞中結(jié)構(gòu)變異這一世界難題，2021年6月30日，北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心湯富酬課題組在Genome Biology上在線發(fā)表了題為“SMOOTH-seq: single-cell genome sequencing of human cells on athird-generation sequencing platform”的研究論文，在國際上率先開發(fā)了基于三代測序（單分子測序）平臺的單細(xì)胞基因組測序技術(shù)。

該研究的主要突破有：

開發(fā)了一種高精度的基于三代測序（單分子測序）平臺的單細(xì)胞基因組測序方法——SMOOTH-seq（Single-MOlecule real-time sequencing of LOng Fragments amplified THrough Transposon insertion）。使用優(yōu)化后的Tn5轉(zhuǎn)座反應(yīng)，SMOOTH-seq能夠從單個細(xì)胞中擴增出平均長度約6kb的基因組片段（測序讀長比單細(xì)胞基因組二代測序技術(shù)長了20倍左右），通過引入與單分子測序平臺兼容的細(xì)胞條形碼使單細(xì)胞基因組DNA擴增子適用于Pacbio sequel II平臺的HiFi測序模式。測序后的數(shù)據(jù)中，產(chǎn)生的環(huán)化測序（circular consensus sequencing, CCS）的讀長平均在6kb左右, 最長可達(dá)43kb。(如圖1所示)。

圖1. SMOOTH-seq的流程和評估

該研究開發(fā)的SMOOTH-seq方法能夠在單個細(xì)胞中高效檢測基因組結(jié)構(gòu)變異。在單個K562細(xì)胞中，當(dāng)測序深度僅為0.4X時，基因組覆蓋度可達(dá)19%。該研究對91個單細(xì)胞進(jìn)行SMOOTH-seq分析，從中檢測到4,790 個缺失事件和5,589個插入事件，其中87%的缺失片段和91% 的插入片段長度小于1kb，檢測到的插入事件DNA片段最長達(dá)到7.7kb。同時，該研究也在K562細(xì)胞中檢測到521個易位事件，包括準(zhǔn)確檢測到兩對經(jīng)典融合基因：BCR-ABL 和NUP214-XKR3。SMOOTH-seq技術(shù)對結(jié)構(gòu)變異的檢測精度高，當(dāng)使用K562大量細(xì)胞的基因組三代測序結(jié)果作為比較基準(zhǔn)時，該研究中使用的K562細(xì)胞系的每個單細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)變異檢測平均精確度為75％，特別是在單個細(xì)胞中檢測插入事件平均精確度為85％。此外，SMOOTH-seq 也可以以1Mb 的分辨率準(zhǔn)確檢測到兩個K562克隆之間的不同拷貝數(shù)變異（CNV）事件。(如圖2所示)

圖2. 單個K562細(xì)胞中CNV及結(jié)構(gòu)變異檢測的精確度

該研究開發(fā)的SMOOTH-seq方法能夠在單個細(xì)胞中高效檢測染色體外環(huán)形DNA（ecDNA）。已有的研究報道表明，染色體外環(huán)形DNA在腫瘤發(fā)生中比較常見，且致癌基因能夠在染色體外環(huán)形DNA中進(jìn)行大量擴增，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。SMOOTH-seq技術(shù)產(chǎn)生的長讀長數(shù)據(jù)，使其能夠被用于在單個細(xì)胞中精準(zhǔn)捕獲小于10kb的全長染色體外環(huán)形DNA。本研究同時開發(fā)了用于鑒定K562細(xì)胞系中的染色體外環(huán)形DNA的生物信息學(xué)分析方法。當(dāng)僅有一個拷貝的Tn5轉(zhuǎn)座酶與一個染色體外環(huán)形DNA分子結(jié)合時，整個環(huán)形DNA分子就可被完整擴增為一個線性片段，即單個讀段即可覆蓋一個染色體外環(huán)形DNA分子的全長序列。通過統(tǒng)計Tn5插入位置不同但長度完全相同的一組讀段，即可判斷它們是否來源于同一個環(huán)形DNA。同時該特征可用于幫助精準(zhǔn)區(qū)分染色體外環(huán)形DNA和串聯(lián)重復(fù)序列(如圖3所示)。

圖3. SMOOTH-seq精準(zhǔn)檢測染色體外環(huán)形DNA的示意圖

該研究開發(fā)的SMOOTH-seq方法能以較高準(zhǔn)確度檢測基因點突變（SNV）。由于三代測序平臺本身的局限性，使用SMOOTH-seq方法在單個細(xì)胞中檢測SNV的假陽性率為2.0 × 10^-5。(如圖4所示)

圖4. SMOOTH-seq 檢測單細(xì)胞K562中SNV的假陽性率

該研究開發(fā)的SMOOTH-seq方法可以在結(jié)直腸癌腫瘤樣本中準(zhǔn)確檢測出各種基因組結(jié)構(gòu)變異事件。在對患者結(jié)直腸癌腫瘤樣本的分析中，以在結(jié)直腸癌的至少2個單細(xì)胞中同時檢測到為標(biāo)準(zhǔn)，該研究檢測出8,594個結(jié)構(gòu)變異事件（4,089個插入事件，3,852個缺失事件，341個易位事件，以及312個重復(fù)事件）。通過將結(jié)直腸癌腫瘤樣本和K562細(xì)胞系中共有的結(jié)構(gòu)變異去除后，該研究共得到3,570個結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞特異性的結(jié)構(gòu)變異事件(1,376 插入事件, 1,661 缺失事件, 230 易位事件以及303 重復(fù)事件)。同時，該研究通過設(shè)置多個對照基因組（包括相應(yīng)的腫瘤組織、與腫瘤相鄰的正常組織、GM12878細(xì)胞系和另一個體的外周血單核細(xì)胞的基因組）對檢測出的結(jié)構(gòu)變異事件進(jìn)行了PCR驗證。此外，該研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌腫瘤樣本和K562細(xì)胞系中共有的結(jié)構(gòu)變異在所有被檢測的多個人類基因組DNA樣品中均存在，說明這些結(jié)構(gòu)變異事件實際上是由于當(dāng)前的人類參考基因組不夠完善，缺失了部分關(guān)鍵序列信息引起的。今后三代測序?qū)⒂兄诮M裝出更完整精準(zhǔn)的人類參考基因組序列。(如圖5所示)

圖5. PCR驗證基因組結(jié)構(gòu)變異的結(jié)果

綜上，該研究開發(fā)的單細(xì)胞基因組單分子測序技術(shù)（SMOOTH-seq），將長讀長的三代測序技術(shù)巧妙運用到了單細(xì)胞基因組測序上，能夠?qū)崿F(xiàn)對于基因組結(jié)構(gòu)變異、染色體外環(huán)形DNA等多種分子事件的高精度檢測，大大提高了單細(xì)胞基因組測序技術(shù)的適用范圍，具有廣闊的應(yīng)用前景。該研究開創(chuàng)了單細(xì)胞基因組單分子測序時代，該研究開發(fā)的單細(xì)胞基因組單分子測序技術(shù)將揭開更多的人類基因組中的“暗物質(zhì)”的奧秘，給人類生物醫(yī)學(xué)研究帶來全新的發(fā)展機遇。

生物島實驗室研究員范小英、北京大學(xué)楊成博士以及北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院博士生李文為該論文的并列第一作者。北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心湯富酬教授為該論文的通訊作者。該研究項目得到了國家自然科學(xué)基金委、北京市科技委和北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心的支持。

來源：北京大學(xué)