8月17日，中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心、神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心研究員楊輝研究組在Protein & Cell上發(fā)表了題為Precise Genome Editing without Exogenous Donor DNA via Retron Editing System in Human Cells 的研究論文，該研究?jī)?yōu)化了Retron系統(tǒng)，首次證明了Retron系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的可適用性，對(duì)于該系統(tǒng)在高等真核生物細(xì)胞中的進(jìn)一步應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

細(xì)菌在與噬菌體的長(zhǎng)期博弈中發(fā)展出許多防御體系，其中就包括CRISPR系統(tǒng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)推動(dòng)了精準(zhǔn)基因組編輯的發(fā)展。CRISPR-Cas9引起的DNA雙鏈斷裂（DSB）主要由非同源末端連接途徑 （NHEJ）而不是同源重組修復(fù)途徑（HDR）介導(dǎo)修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，使用單鏈DNA作為模板、提高Cas9誘導(dǎo)的DSB位點(diǎn)附近的模板DNA濃度，可以有效提高HDR效率。近來(lái)發(fā)現(xiàn)Retron系統(tǒng)也在細(xì)菌防御噬菌體中發(fā)揮重要作用。2018年，美國(guó)斯坦福大學(xué)研究人員開(kāi)發(fā)的CRISPEY將Retron系統(tǒng)與CRIPSR系統(tǒng)結(jié)合，通過(guò)Retron系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈供體模板DNA，并將其與sgRNA共價(jià)偶聯(lián)。在酵母細(xì)胞中，CRISPEY可以在酵母細(xì)胞中高效精確地（>80%編輯效率）敲入長(zhǎng)達(dá)700bp的DNA序列。但是，Retron系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞是否可以工作尚未研究。

楊輝研究組通過(guò)將四種已被報(bào)道具有功能的retron系統(tǒng)（Ec48、Ec73、Ec86和Ec107）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，證明了細(xì)菌retron系統(tǒng)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈DNA。通過(guò)將retron RT融合于Cas9蛋白的N端或C端 (RT-Cas9 or Cas9-RT)，以及將retron ncRNA連接于sgRNA的5’端或3’端（5’rgRNA or 3’rgRNA），研究發(fā)現(xiàn)Cas9-Ec73RT和3’ Ec73 rgRNA的組合能最有效地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)完成精準(zhǔn)DNA編輯（~10%編輯效率）。該研究初步探索了Retron editing在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用, 驗(yàn)證了Retron Editing用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞精準(zhǔn)基因編輯的可行性。

相較于目前常用的DNA單堿基編輯及Prime editing，依賴(lài)HDR機(jī)制的Retron editing受到PAM位置的限制相對(duì)較小，并且Retron editing系統(tǒng)不需要額外提供外源供體模板DNA。此外，目前在植物細(xì)胞中由于HDR效率低及外源同源重組供體模板DNA遞送困難等原因造成基因 (尤其是長(zhǎng)片段) 敲入的效率較低，不需要提供外源供體模板DNA的Retron editing系統(tǒng)可能為植物基因組編輯提供新選擇。未來(lái)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化升級(jí)工作，Retron editing系統(tǒng)有望應(yīng)用于腦疾病治療及作物性狀改良等領(lǐng)域。

論文鏈接

Retron Editing工作示意圖及其與DNA堿基編輯器、Prime editing的比較

來(lái)源： 腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心