脊椎動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在發(fā)育過程中會(huì)通過V(D)J重排產(chǎn)生多樣化的細(xì)胞表面受體來識(shí)別外來抗原，參與機(jī)體的適應(yīng)性免疫過程。這些在基因組上串聯(lián)分布的V、D、J片段兩端帶有重組信號(hào)序列（Recombination signal sequences , RSSs），可以被淋巴細(xì)胞中特異表達(dá)的重排酶RAG復(fù)合物識(shí)別并切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（Double strand break, DSB），在細(xì)胞的非同源末端鏈接（Non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)通路下，不同的V、D、J片段被連接起來從而產(chǎn)生多樣化的細(xì)胞表面受體¹。重排酶RAG是由重組激活基因（Recombination activating genes，RAGs）編碼的RAG1和RAG2兩個(gè)蛋白質(zhì)組成，它們以復(fù)合物的形式靶向基因組中的RSS序列從而發(fā)揮V(D)J重排功能。其中，RAG1含有核酸酶活性，是催化活性中心；而RAG2無明確的蛋白質(zhì)功能域，但可以將RAG1的活性提高數(shù)百到數(shù)千倍^2-3。由于RAG復(fù)合物會(huì)在基因組中產(chǎn)生DSB，因此細(xì)胞將通過一定方式控制RAG復(fù)合物的功能活性以保證細(xì)胞中的基因組穩(wěn)定性。已有的研究表明，RAG2的表達(dá)受到細(xì)胞周期的調(diào)控，其只在G1期表達(dá)而在進(jìn)入S期后就快速降解，因此淋巴細(xì)胞中只有在G1時(shí)期才會(huì)發(fā)生VDJ重排過程^4-5。而RAG2如何調(diào)控RAG1，以及細(xì)胞為何選擇降解RAG2而不是RAG1和RAG2，都是待解決的問題。

2021年10月12日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心胡家志研究員課題組在Cell Reports發(fā)表了題為“RAG2 abolishes RAG1 aggregation to facilitate V(D)J recombination”的研究論文，系統(tǒng)性地闡述了在細(xì)胞周期中RAG2是如何調(diào)控RAG1的凝聚從而調(diào)控RAG1在細(xì)胞內(nèi)的重排酶活性的，并且從進(jìn)化的角度闡述了脊椎動(dòng)物中RAG1和RAG2共進(jìn)化的生物學(xué)意義。

該研究通過表達(dá)以及內(nèi)源熒光標(biāo)記方式在多種細(xì)胞系中利用共聚焦成像技術(shù)觀察并證明了人RAG1蛋白而不是RAG2在細(xì)胞核內(nèi)形成凝聚體的現(xiàn)象（圖1a-b）；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RAG2的存在可以破壞RAG1的凝聚狀態(tài)（圖1c）。研究人員接著利用實(shí)驗(yàn)室2019年開發(fā)的PEM-seq高通量測(cè)序方法，在整合了RSS序列的293T細(xì)胞中檢測(cè)了凝聚狀態(tài)和游離狀態(tài)的RAG1活性。測(cè)序結(jié)果顯示，凝聚態(tài)的RAG1幾乎不能介導(dǎo)V(D)J重排，相反游離態(tài)的RAG1的重排酶活性增加了1154倍（圖1d）。當(dāng)利用RNA結(jié)合蛋白FUS迫使RAG1一直以凝聚體形式存在時(shí)，其重排酶活性也會(huì)被抑制。這表明細(xì)胞內(nèi)RAG1的重排酶活性是受到自身凝聚體狀態(tài)的調(diào)控的，這也能很好地闡述發(fā)育中的淋巴細(xì)胞在G1周期之外如何保護(hù)自身基因組的完整性。為了進(jìn)一步研究RAG1凝聚體形成機(jī)制，研究人員進(jìn)行了一系類氨基酸功能位點(diǎn)的突變（圖1a），發(fā)現(xiàn)RAG1蛋白的催化活性中核心氨基酸DDE和位于蛋白質(zhì)N端核定位信號(hào)對(duì)其產(chǎn)生凝聚作用發(fā)揮了重要的作用。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)RAG2是通過與RAG1直接的相互作用來破壞RAG1自身的凝聚狀態(tài)，而不依賴RAG2的PHD功能域（圖1c）。

圖1. RAG2調(diào)控RAG1在細(xì)胞核內(nèi)的凝聚狀態(tài)

研究人員還從進(jìn)化角度探究了不同脊椎動(dòng)物的RAG2蛋白對(duì)于人源RAG1凝聚體調(diào)控的普適性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有人源的RAG2能夠最大程度地破壞RAG1的凝聚狀態(tài)從而起始VDJ重排活性，來自小鼠的RAG2只能恢復(fù)很弱的功能，而來自斑馬魚的RAG2則不能調(diào)控人源RAG1的凝聚狀態(tài)（圖2），表明了RAG2的起源可能跟RAG1一樣早，兩者共同進(jìn)化，因此在物種之間表現(xiàn)出了一些不同的性質(zhì)。

圖2.不同物種RAG2對(duì)人RAG1凝聚狀態(tài)的調(diào)控

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)了人淋巴細(xì)胞中RAG1的凝聚體現(xiàn)象以及RAG2參與RAG復(fù)合物活性調(diào)控的作用機(jī)制，論文最后使用“越獄”模型來對(duì)該作用機(jī)制進(jìn)行更形象的描述，即在S/G2/M時(shí)期，細(xì)胞內(nèi)的RAG1依賴于自身的結(jié)構(gòu)特征或是在細(xì)胞核內(nèi)無膜細(xì)胞器（如核仁）等的幫助下，在細(xì)胞核內(nèi)以凝聚體的形式存在。該凝聚體像“監(jiān)獄”一樣，將重排酶RAG1與基因組上的RSS底物隔絕開來，而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G1期，細(xì)胞內(nèi)游離存在的RAG2通過直接結(jié)合到RAG1的表面，將RAG1從凝聚體“監(jiān)獄”中釋放出來，形成游離態(tài)的RAG復(fù)合體從而起始淋巴細(xì)胞內(nèi)的V(D)J重排事件，維持了淋巴細(xì)胞的正常生理過程。

圖3.淋巴細(xì)胞內(nèi)重排酶RAG1活性調(diào)控的“越獄”模型

胡家志為該論文的通訊作者。博士研究生甘婷婷為論文的第一作者。博士研究生王渝鴻，博士后劉陽在該工作中亦有重要貢獻(xiàn)。該論文還得到了耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院David Schatz院士的支持和幫助。該工作得到了北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及生命科學(xué)學(xué)院儀器中心（成像平臺(tái)及流式平臺(tái)）的大力支持。

參考文獻(xiàn)：

1.Alt, F.W., Zhang, Y., Meng, F.L., Guo, C., and Schwer, B. (2013). Mechanisms of programmed DNA lesions and genomic instability in the immune system. Cell 152, 417–429.

2.Oettinger, M.A., Schatz, D.G., Gorka, C., and Baltimore, D. (1990). RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science 248, 1517—1523.

3.Schatz, D.G., Oettinger, M.A., and Baltimore, D. (1989). The V(D)J recombination activating gene, RAG-1. Cell 59, 1035–1048.

4.Lin, W.C., and Desiderio, S. (1993). Regulation of V(D)J recombination activator protein RAG-2 by phosphorylation. Science 260, 953–959.

5.Lin, W.C., and Desiderio, S. (1994). Cell cycle regulation of V(D)J recombination-activating protein RAG-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2733–2737.

來源：北京大學(xué)