液-液相分離（Liquid-liquid phase separation, LLPS）是細(xì)胞內(nèi)很多重要生命過程的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)機(jī)制。在真核細(xì)胞中，LLPS能讓各種相關(guān)的生物分子富集，幫助細(xì)胞形成各種無膜結(jié)構(gòu)，如P顆粒（P-granules）、核仁（nucleoli）、異染色質(zhì)（heterochromatin）和應(yīng)激顆粒（stress-granules）等，從而實(shí)現(xiàn)提高生化反應(yīng)效率，或是在壓力環(huán)境下保護(hù)mRNA和蛋白質(zhì)等重要細(xì)胞成分。LLPS具有可逆性并對(duì)環(huán)境因素高度敏感，近些年被證明是細(xì)胞響應(yīng)外界壓力及快速動(dòng)態(tài)劃分細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)的重要機(jī)制。與真核細(xì)胞相比，原核細(xì)胞內(nèi)部更為擁擠并缺少有膜細(xì)胞器。液-液相分離機(jī)制在原核細(xì)胞中發(fā)揮了怎樣的作用還存在較多未知。

論文截圖

北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）、生命科學(xué)學(xué)院白凡研究員課題組曾于2018年在Molecular Cell雜志上發(fā)表題為“ATP-dependent dynamic protein aggregation regulates bacterial dormancy depth critical for antibiotic tolerance”的研究論文，報(bào)道了細(xì)菌中存在的一種可動(dòng)態(tài)聚集和分散的新型細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)——蛋白質(zhì)沉淀聚集體（aggresomes）。Aggresomes在顯微鏡明場(chǎng)下呈現(xiàn)為分布在細(xì)菌胞內(nèi)的小黑點(diǎn)，在細(xì)胞遭遇外界壓力（營(yíng)養(yǎng)缺乏、抗生素攻擊）時(shí)形成，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)；在外界環(huán)境改善后，aggresomes被清除，細(xì)菌重新恢復(fù)生長(zhǎng)。圍繞細(xì)菌aggresomes形成的微觀機(jī)制，2021年10月20日，白凡課題組與英國(guó)約克大學(xué)的Mark C. Leake教授課題組合作在Science Advances雜志上發(fā)表題為“Membraneless organelles formed by liquid-liquid phase separation increases bacterial fitness”的研究論文，通過單分子高分辨率熒光顯微追蹤和多尺度數(shù)學(xué)建模，證明aggresomes是通過液-液相分離機(jī)制形成的無膜細(xì)胞器，在細(xì)菌對(duì)抗逆境和抗生素耐藥中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖1? 使用單分子高分辨率熒光顯微成像技術(shù)研究細(xì)菌蛋白質(zhì)沉淀聚集體的形成機(jī)制

研究團(tuán)隊(duì)首先選擇了三種在aggresomes中富集的蛋白質(zhì)（HslU, Kbl, AcnB）作為研究對(duì)象，分別為其構(gòu)建帶有熒光標(biāo)記的融合蛋白。通過在細(xì)菌內(nèi)過表達(dá)HokB（一種細(xì)菌Toxin），降低細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ATP水平，從而人為誘導(dǎo)aggresomes的形成（圖1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種蛋白在加入aggresomes的過程中展現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)特征，其中HslU最快形成熒光聚集體，隨后是Kbl，而AcnB最晚。

研究者選擇了響應(yīng)速度最快的HslU蛋白作為aggresomes的生物標(biāo)記，通過單分子熒光追蹤來探索aggresomes形成的時(shí)空動(dòng)態(tài)特征。運(yùn)用Slimfield單分子追蹤技術(shù)（圖1C），研究者獲得了單個(gè)HslU-EGFP分子在aggresomes內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)軌跡和平均擴(kuò)散系數(shù)，發(fā)現(xiàn)HslU蛋白在aggresomes內(nèi)部能夠自由移動(dòng)，由此說明aggresome內(nèi)并非固態(tài)；與此同時(shí)，在顯微鏡下觀察aggresomes形成的動(dòng)態(tài)過程，發(fā)現(xiàn)在aggresomes形成早期，細(xì)胞內(nèi)不同aggresomes之間會(huì)發(fā)生碰撞—融合過程，兩個(gè)較小的聚合體能夠融合形成一個(gè)更大的聚合體（圖2C），這也說明aggresomes具有液滴狀性質(zhì)；研究者進(jìn)一步使用了熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP）來定量aggresome內(nèi)部蛋白質(zhì)分子的流動(dòng)性。當(dāng)使用高強(qiáng)度會(huì)聚激光淬滅掉aggresome中一半的熒光蛋白后，可以觀察到被淬滅區(qū)域的熒光信號(hào)緩慢回升（圖2D，2E），證明aggresomes內(nèi)部EGFP熒光分子能夠進(jìn)行自由交換。以上多重證據(jù)表明，沉淀聚集體內(nèi)的蛋白質(zhì)并不是緊密聚合，而是處于可部分自由運(yùn)動(dòng)的液體狀態(tài)。進(jìn)一步，通過細(xì)菌胞內(nèi)ATP測(cè)量，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度下降而觸發(fā)的液-液相分離是aggresomes形成的核心機(jī)制。

圖2? 液-液相分離驅(qū)動(dòng)細(xì)菌蛋白質(zhì)沉淀聚合體的形成

研究團(tuán)隊(duì)使用Individual-Protein-Based Model（IPBM）模擬了蛋白質(zhì)沉淀液滴逐漸聚集而發(fā)生相分離形成較大無膜細(xì)胞器的過程。通過對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散—碰撞—聚集過程進(jìn)行Monte-Carlo模擬，模型可以定量解釋和驗(yàn)證之前在實(shí)驗(yàn)中所觀察到的結(jié)果（圖3）。該數(shù)學(xué)模型不僅解釋了aggresomes形成的機(jī)制，也確定了aggresomes形成過程中多個(gè)重要的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

圖3? 數(shù)學(xué)模型模擬aggresomes形成的精細(xì)過程

研究團(tuán)隊(duì)證明在多種常見細(xì)菌中降低細(xì)胞內(nèi)ATP均可誘導(dǎo)aggresomes的產(chǎn)生，暗示aggresomes的形成可能是細(xì)菌對(duì)抗外界壓力的一種普適反應(yīng)。為了探究aggresomes的生物學(xué)功能，研究團(tuán)隊(duì)通過化學(xué)小分子阻斷和基因敲除的手段構(gòu)建出讓aggresomes無法正常形成的缺陷型菌株，與野生型菌株相比，缺陷型在抗生素及噬菌體攻擊下更容易死亡。種種證據(jù)表明，aggresomes的形成在細(xì)菌對(duì)抗逆境和抗生素耐藥中發(fā)揮了關(guān)鍵的生物學(xué)作用。

本研究拓展了液-液相分離機(jī)制在原核生物中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞利用相分離來動(dòng)態(tài)調(diào)整蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中的時(shí)空分布，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗外界環(huán)境壓力的能力和抗生素耐受。特別地，本研究揭示的液-液相分離對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的響應(yīng)是一種全新的調(diào)控機(jī)制，值得更進(jìn)一步的研究。

北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院金心博士，博士研究生羅昕瑋，英國(guó)約克大學(xué)物理系Ji-Eun Lee博士，Charley Schaefer博士為本論文的并列第一作者。白凡和Mark C. Leake為本論文的共同通訊作者。該研究得到了來自國(guó)家自然科學(xué)基金委、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北京大學(xué)國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心的支持。

來源：北京大學(xué)