2022年2月9日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭永團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)第一醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院合作，在國際著名學(xué)術(shù)期刊《分析化學(xué)》（Analytical Chemistry）發(fā)表了題為“用于脊髓性肌肉萎縮癥分子診斷和疾病嚴(yán)重程度評(píng)估的單管多重?cái)?shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法”（Single-Tube Multiplex Digital Polymerase Chain Reaction Assay for Molecular Diagnosis and Prediction of Severity of Spinal Muscular Atrophy）的文章，并被選為雜志封面。脊髓性肌萎縮癥（Spinal muscular atrophy，SMA）是兒童最常見的遺傳性神經(jīng)肌肉病，目前用于SMA相關(guān)基因檢測(cè)和拷貝數(shù)確定的方法復(fù)雜、耗時(shí)或無法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)。本研究基于數(shù)字PCR技術(shù)建立了能夠在單管完成SMN1外顯子7和8與SMN2外顯子7和8拷貝數(shù)檢測(cè)的方法，具有準(zhǔn)確、快速、操作簡(jiǎn)單、樣本用量少和適用于多種類型樣本的優(yōu)勢(shì)，為SMA的分子診斷、大規(guī)模篩查和疾病嚴(yán)重程度評(píng)估提供了一個(gè)有力的工具。

2.研究背景

2021年12月，國家醫(yī)保局公布一批新藥進(jìn)醫(yī)保，全球首個(gè)用于治療SMA的高價(jià)藥物——諾西那生鈉注射液名列其中，罕見病SMA也因此受到大眾關(guān)注。SMA是一種嚴(yán)重的神經(jīng)肌肉疾病，其特征是脊髓前角α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退化變性，導(dǎo)致近端肌肉逐漸無力、萎縮和癱瘓，發(fā)病率約為1/10000，人群攜帶率約為1/50，是導(dǎo)致新生兒死亡的重要遺傳因素之一。SMA是一種常染色體隱性遺傳病，95%的患者是由于SMN1基因7號(hào)外顯子純合缺失而致?。ù蟛糠?i>SMN1基因8號(hào)外顯子共同缺失）；另一個(gè)與SMN1高度同源的基因SMN2已被證實(shí)與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，SMN2的拷貝數(shù)在治療與用藥中被作為重要參考數(shù)據(jù)。因此，精準(zhǔn)的檢測(cè)出SMN1和SMN2的拷貝數(shù)對(duì)于臨床疾病診斷、攜帶者篩查、疾病嚴(yán)重性預(yù)測(cè)評(píng)估、治療和預(yù)后至關(guān)重要。

3.方法與結(jié)果

本研究建立了一種基于數(shù)字PCR單管檢測(cè)SMN1外顯子7和8、SMN2外顯子7和8及內(nèi)參基因的方法，通過數(shù)字PCR技術(shù)絕對(duì)定量目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的模板拷貝數(shù)，計(jì)算目標(biāo)基因與內(nèi)參基因模板拷貝數(shù)的比值來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)（圖1）。作者以不同的熒光染料標(biāo)記5個(gè)基因的探針，并配合新羿生物的5色微液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了5個(gè)基因單管檢測(cè)。此外，為了能夠區(qū)分高度同源的SMN1和SMN2基因（在外顯子7和外顯子8上各只有1個(gè)堿基的差異），作者使用了小溝結(jié)合物（Minor groove binder，MGB）和鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA）對(duì)檢測(cè)探針進(jìn)行修飾。

圖1基于數(shù)字PCR的SMA檢測(cè)流程

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，作者收集了共317例不同類型的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，包括外周血、羊水、絨毛、口腔拭子和干血斑。在317例樣本中，共有22例患者、72例攜帶者和223例正常人（圖2），結(jié)果顯示該方法對(duì)于不同類型的樣本都能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)基因拷貝數(shù)準(zhǔn)確的檢測(cè)。此外，作者也觀察到了SMN2基因拷貝數(shù)更多的SMA患者具有更輕的表型；通過對(duì)目標(biāo)基因的同時(shí)檢測(cè)，亦觀察到患者、攜帶者和正常人群中都出現(xiàn)基因轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生融合基因的情況。

圖2不同類型的臨床樣本的SMN1和SMN2檢測(cè)結(jié)果分布（TGR：Target gene ratio,目標(biāo)基因與內(nèi)參基因模板拷貝數(shù)的比值）

與現(xiàn)有的檢測(cè)方法如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）和熒光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）相比，本方法能精準(zhǔn)檢測(cè)更多靶標(biāo)，且對(duì)模板量要求低（≥ 1.5 ng）；與金標(biāo)準(zhǔn)方法多重連接探針擴(kuò)增（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）相比，本方法檢測(cè)周期更短（首次出結(jié)果24 hvs2.5 h）、操作更簡(jiǎn)單、對(duì)模板量的要求低和適用于更多種類型樣本。

4.研究結(jié)論

本工作研發(fā)了基于數(shù)字PCR技術(shù)的SMA精準(zhǔn)檢測(cè)方法，能夠在單管完成SMN1外顯子7和8與SMN2外顯子7和8拷貝數(shù)的檢測(cè)，具有檢測(cè)準(zhǔn)確、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)限低和適用于多種類型樣本的優(yōu)勢(shì)，為SMA分子診斷、大規(guī)模篩查和疾病嚴(yán)重程度評(píng)估提供了一個(gè)有力的工具。

5.作者介紹

清華大學(xué)陳芊如與首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院閆有圣為該研究的共同第一作者，清華大學(xué)郭永與北京大學(xué)第一醫(yī)院馬祎楠為該研究的共同通訊作者。該研究得到了科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、清華大學(xué)春風(fēng)基金和國家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金的聯(lián)合資助。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04403

來源：清華大學(xué)