自從2009年單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)被首次報道以來，單細(xì)胞組學(xué)測序技術(shù)迅猛發(fā)展，為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了一系列強(qiáng)大、精準(zhǔn)的研究工具。2022年2月28日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學(xué)學(xué)院湯富酬教授與文路副研究員受邀在Precision Clinical Medicine上發(fā)表綜述，從四個方面總結(jié)了近年來單細(xì)胞組學(xué)測序技術(shù)的最新研究進(jìn)展，特別聚焦于其在人類干細(xì)胞研究方面的應(yīng)用。

第一、單細(xì)胞表觀基因組測序技術(shù)的最新進(jìn)展。

表觀遺傳調(diào)控是細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，其包括染色質(zhì)狀態(tài)、三維基因組、DNA甲基化、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等多個互為補(bǔ)充、協(xié)同調(diào)控的層面，以實現(xiàn)在每個細(xì)胞中精確調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的目的。近年來單細(xì)胞表觀基因組測序技術(shù)發(fā)展迅速，尤其是基于Tn5轉(zhuǎn)座子的染色質(zhì)可及性測序ATAC-seq技術(shù)，因其簡便高效而得到大力發(fā)展和廣泛使用?；趀nzyme-tethering策略的CUT&Tag等技術(shù)為組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的單細(xì)胞分析提供了新的工具。文章從單細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)、三維基因組、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)/轉(zhuǎn)錄組雙組學(xué)五個方面進(jìn)行了綜述。

第二、單細(xì)胞基因組測序技術(shù)用于譜系追蹤的最新進(jìn)展。

模式動物中的基于轉(zhuǎn)基因標(biāo)記和單細(xì)胞組學(xué)測序的譜系追蹤技術(shù)近年來取得長足進(jìn)展，但是由于倫理限制，這些技術(shù)無法用于人類在體組織器官的譜系追蹤。組織器官發(fā)育經(jīng)歷了不斷的細(xì)胞分裂與分化。然而，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制并非百分百精確，每次細(xì)胞分裂都會隨機(jī)產(chǎn)生少量突變，這些體細(xì)胞突變不斷積累，可作為識別和追蹤細(xì)胞譜系關(guān)系的獨(dú)特標(biāo)志，這就從根本上解決了對人體組織器官細(xì)胞的譜系追蹤問題。體細(xì)胞突變的類型包括單核苷酸變異（SNV）、微衛(wèi)星序列改變、轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列改變、拷貝數(shù)變異（CNV）和線粒體突變等。近年來，研究通過單細(xì)胞分辨率的基因組突變測序分析，初步探索了人類胚胎和器官發(fā)育譜系圖譜。文章從單細(xì)胞基因組測序技術(shù)和基因組突變信息兩方面進(jìn)行了綜述。

第三、單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的最新進(jìn)展。

細(xì)胞在生物體內(nèi)所處的空間位置常常對其命運(yùn)決定和生理功能有重要影響。近年來，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)進(jìn)展迅速，這些技術(shù)尤其適用于無法進(jìn)行遺傳學(xué)標(biāo)記的人類組織樣本的研究。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)包括三類技術(shù)：第一類是單分子熒光原位雜交技術(shù)，第二類是原位測序技術(shù)，第三類是基于原位捕獲策略的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。前兩類技術(shù)具有單細(xì)胞分辨率，第三類技術(shù)正在接近單細(xì)胞分辨率。文章對這些技術(shù)進(jìn)行了綜述。

第四、基于第三代測序技術(shù)（單分子測序技術(shù)）的單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的最新進(jìn)展。

近年來，包括納米孔測序和單分子熒光測序在內(nèi)的單分子長讀長測序技術(shù)（即第三代測序技術(shù)）發(fā)展迅速。三代單分子長讀長測序技術(shù)用于單細(xì)胞組學(xué)與二代短讀長測序技術(shù)相比有幾方面優(yōu)點(diǎn)（圖1）。其一、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組三代測序（單分子長讀長測序）方法對全長轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行直接測序，從而能夠有效地檢測可變剪接轉(zhuǎn)錄本。湯富酬課題組與王洋團(tuán)隊合作開發(fā)了基于三代單分子測序平臺的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法SCAN-seq，在小鼠植入前胚胎中檢測到了27,250 個未注釋轉(zhuǎn)錄本（Fan et al., 2020）。其二、單細(xì)胞基因組三代測序方法能夠有效地檢測結(jié)構(gòu)變異，特別是復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異。雖然二代短讀長測序能夠有效地檢測包括單核苷酸變異和短插入或缺失在內(nèi)的基因組變異，但是對于包括長片段插入或缺失、基因組重復(fù)、異位和環(huán)狀DNA等在內(nèi)的基因組結(jié)構(gòu)變異的檢測卻有很大局限性。湯富酬課題組首次開發(fā)了基于三代單分子測序平臺的單細(xì)胞基因組測序方法SMOOTH-seq，其平均測序讀長6000bp（相比于二代測序的300bp讀長增加了20倍），從91個K562單細(xì)胞中檢測到4,790 個缺失事件和 5,589個插入事件, 其中87%的缺失片段和 91% 的插入片段長度小于1kb，檢測到的插入事件DNA片段最長達(dá)到 7.7kb（Fan et al., 2021）。其三、單分子納米孔測序方法可以直接檢測DNA分子上的表觀修飾。三個研究小組最近報道了基于三代單分子測序平臺的染色質(zhì)可及性測序方法（SMAC-seq, Fiber-seq和nanoNOMe）。盡管尚未到單細(xì)胞水平，但這些技術(shù)展示了研究長距離相鄰基因組區(qū)域的協(xié)同調(diào)控關(guān)系的巨大潛力和廣闊應(yīng)用前景。

圖1 基于第三代單分子長讀長測序平臺的單細(xì)胞多組學(xué)。紅色與綠色表示已經(jīng)實現(xiàn)的檢測，其中紅色表示基于三代長讀長測序平臺的單細(xì)胞多組學(xué)方法，與基于二代短讀長測序平臺的方法相比所具有優(yōu)勢的檢測方面

單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)近年來進(jìn)展迅速，但是仍然有諸多可改進(jìn)之處。單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)有很強(qiáng)的普適性。它具備高靈敏度和高精確度但仍有待加強(qiáng)。它的通量、自動化和檢測速度近年來迅速提高且成本不斷下降，但是仍尚未達(dá)到臨床檢測的強(qiáng)勁需求。尤其對于人類在體干細(xì)胞研究，它的時空分辨率還有待大幅提高（圖2）。

圖2 單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)的當(dāng)前狀態(tài)

湯富酬和文路為該論文的共同通訊作者。該研究項目得到了國家自然科學(xué)基金委、北京市科技委的支持。

來源：北京大學(xué)