人類受精卵形成初期，自身基因不表達(dá)，而需要依賴卵子攜帶的母源因子執(zhí)行細(xì)胞功能。隨著受精卵的不斷分裂，當(dāng)?shù)竭_(dá)8細(xì)胞期時(shí)，卵子來(lái)源的母源因子逐漸降解消除，而胚胎自身的基因被激活，個(gè)體開始依賴自身的基因表達(dá)完成后續(xù)發(fā)育。8細(xì)胞期發(fā)生的該過(guò)程被稱作合子基因組激活，是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，該過(guò)程的異?？芍苯訉?dǎo)致胚胎發(fā)育的停止。因此，研究8細(xì)胞期細(xì)胞調(diào)控機(jī)制對(duì)于保證良好的早期胚胎發(fā)育有重要意義。

建立人類8細(xì)胞樣細(xì)胞（8CLC）體外誘導(dǎo)的平臺(tái)

我們?cè)谇捌谕ㄟ^(guò)篩選，建立了新型的人類8CLC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基e4CL和兩種不同的8CLC誘導(dǎo)方法：直接誘導(dǎo)法和階段誘導(dǎo)法（圖1a）。誘導(dǎo)后獲得的全能性細(xì)胞（8CLC）比例為10-15 %。我們構(gòu)建了可用于篩選純化8CLC的報(bào)告基因細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠幫助我們對(duì)大量純化8CLC進(jìn)行功能和機(jī)制研究。為了測(cè)試此誘導(dǎo)方法產(chǎn)生的8CLC反應(yīng)8C胚胎細(xì)胞的相似度，我們將階段誘導(dǎo)法獲得的8CLC與體內(nèi)胚胎數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合（圖1b）。誘導(dǎo)的細(xì)胞逐漸從類似胚胎第7天（E7）的狀態(tài)回到類似胚胎第5天（E5），當(dāng)誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞與胚胎第三天（E3，即8細(xì)胞期）類似（圖1b）。我們還從染色質(zhì)開放狀態(tài)、DNA甲基化修飾等多個(gè)角度驗(yàn)證了8CLC和8細(xì)胞期胚胎的相似性。

圖1 人全能性8CLC的誘導(dǎo)方法及與胚胎發(fā)育時(shí)期的比較

鑒定8CLC轉(zhuǎn)換中的分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了探究8CLC的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究人員基于單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，使用加權(quán)基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析（scWGCNA）定義了共表達(dá)的基因模塊和差異表達(dá)的中樞基因。該分析揭示了不同細(xì)胞狀態(tài)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）。8CLC GRN的核心參與者包括DPPA3、TPRX1、ZSCAN4和DUXA等（圖2a）。這些GRN中許多基因的功能在很大程度上是未知的，反映了我們迄今為止對(duì)人類早期發(fā)育階段和全能性的有限了解。

此外，研究人員比較了同一時(shí)間點(diǎn)8CLC與其他細(xì)胞（非8CLC）中的差異表達(dá)基因（DEG）。8CLC高表達(dá)基因中包含了預(yù)測(cè)出的8CLC GRN關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括DPPA3、TPRX1、ZSCAN4、DUXA和ZNF280A。研究人員對(duì)其中表達(dá)差異最顯著的DPPA3和TPRX1進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。干擾DPPA3的表達(dá)抑制8CLC的誘導(dǎo)（圖2b），且該作用是由DNA甲基化水平上調(diào)引起的。同時(shí)，敲除TPRX1也能顯著抑制8CLC的誘導(dǎo)（圖2c），說(shuō)明DPPA3和TPRX1是8CLC狀態(tài)建立的關(guān)鍵調(diào)控因子。

通過(guò)這部分內(nèi)容，研究人員提供了8CLC轉(zhuǎn)換的分子路線圖，并且剖析了其中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定出DPPA3和TPRX1為誘導(dǎo)8CLC的兩個(gè)核心因子。見(jiàn)圖2。

圖2 8CLC基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和核心調(diào)控因子DPPA3、TPRX1的功能驗(yàn)證

評(píng)估8CLC的分化潛能

利用純化的8CLC，研究團(tuán)隊(duì)從滋養(yǎng)層細(xì)胞分化能力、模擬人類囊胚形成能力和畸胎瘤分化過(guò)程中產(chǎn)生胚外組織細(xì)胞的能力等方面系統(tǒng)評(píng)估了8CLC的分化潛能。

分選后的8CLC在3D培養(yǎng)條件下，可以自發(fā)形成類似人胚胎囊胚階段的結(jié)構(gòu)（稱為類囊胚）。利用囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)標(biāo)記蛋白OCT4 和滋養(yǎng)外胚層標(biāo)記蛋白GATA2進(jìn)行免疫熒光，驗(yàn)證了8CLC產(chǎn)生的類囊胚在標(biāo)記蛋白上與囊胚的相似性（圖3a）。此外，我們對(duì)該類囊胚結(jié)構(gòu)進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析結(jié)果顯示全能性8CLC產(chǎn)生的類囊胚具有上胚層、下胚層和滋養(yǎng)外胚層，與胚胎構(gòu)成類似（圖3b,c）。

畸胎瘤常被用來(lái)評(píng)估多能干細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育潛能，也是研究譜系發(fā)育的良好模型。為了檢測(cè)8CLC的發(fā)育潛能，我們利用不同多能性狀態(tài)的細(xì)胞和分選出的8CLC產(chǎn)生畸胎瘤，并進(jìn)行了基于DNBelab C4平臺(tái)的高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。實(shí)驗(yàn)共得到了227,598 個(gè)單細(xì)胞，注釋出24種細(xì)胞類型。結(jié)果顯示，分選的8CLC來(lái)源的畸胎瘤包含胚胎外滋養(yǎng)細(xì)胞譜系和更豐富的其他譜系如生血內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等（圖3d）。

總的來(lái)說(shuō)，8CLC具有胚胎的三胚層和胚外的滋養(yǎng)層發(fā)育潛能，即具有全能性，在功能層面上與人類8細(xì)胞期細(xì)胞的分化能力契合，是研究人類早期胚胎發(fā)育的可靠材料。本文涉及的所有實(shí)驗(yàn)均符合國(guó)際倫理規(guī)范的要求，并經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的倫理審查。

圖3 利用類囊胚模型和畸胎瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證8CLC全能性發(fā)育潛能

該研究項(xiàng)目填補(bǔ)了體外人8細(xì)胞期胚胎樣細(xì)胞的空白，與人多能性狀態(tài)的細(xì)胞相比，全能性的8CLC具有更好的發(fā)育和分化能力等眾多優(yōu)勢(shì)。該成果對(duì)早期胚胎發(fā)育相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了新的體外研究體系，有助于我們理解早期胚胎發(fā)育過(guò)程及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與疾病發(fā)生的關(guān)系，為防治出生缺陷及多種發(fā)育源性疾病提供理論基礎(chǔ)和可行路徑；同時(shí)也為全能性細(xì)胞用于細(xì)胞治療和疾病建模提供了更好的模型選擇?？蒲袌F(tuán)隊(duì)將會(huì)進(jìn)一步建立高效率、高純度的人8CLC全能性細(xì)胞生產(chǎn)平臺(tái)，并利用全能性細(xì)胞制備功能性細(xì)胞和藥物篩選平臺(tái)。

Md. Abdul Mazid、Carl Ward、駱志偉和劉傳宇為該論文的共同第一作者，Miguel A. Esteban、李文娟、劉龍奇和Md. Abdul Mazid為論文的共同通訊作者。