人類基因組的非編碼序列中，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要功能元件。大多數(shù)情況下，激活的增強(qiáng)子會(huì)與近端啟動(dòng)子發(fā)生直接互作。同時(shí)，也存在一部分增強(qiáng)子能夠通過染色質(zhì)成環(huán)、蛋白質(zhì)寡聚化及RNA聚合酶II結(jié)合增強(qiáng)子沿染色質(zhì)追蹤等方式與線性基因組中的遠(yuǎn)端啟動(dòng)子互作來發(fā)揮調(diào)控功能，增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的遠(yuǎn)距離互作體現(xiàn)了調(diào)控元件活性能夠影響三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。近年來，越來越多的研究表明增強(qiáng)子與啟動(dòng)子互作對(duì)于形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，如轉(zhuǎn)錄因子和聚合酶在細(xì)胞核中不是均一分布，而傾向于聚集在轉(zhuǎn)錄活躍或染色質(zhì)致密的區(qū)域；轉(zhuǎn)錄過程如轉(zhuǎn)錄延伸也能夠影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。這些在空間聚集成簇且轉(zhuǎn)錄活躍的調(diào)控元件是否能夠維持大范圍染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，目前還沒有系統(tǒng)性的研究。

2022年4月7日，北京大學(xué)魏文勝課題組與加州大學(xué)圣地亞哥分校（UCSD）王巍課題組在Nucleic Acids Research上聯(lián)合發(fā)表了題為“Regulatory elements can be essential for maintainingbroad chromatin organization and cell viability” 的研究論文，該研究基于前期工作中建立的EpiTensor算法（Zhu et al. Nature Communications 2016）發(fā)現(xiàn)了基因組中活躍的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子互作中心位點(diǎn)，將該類位點(diǎn)稱為hotspot。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)非編碼hotspot增強(qiáng)子位點(diǎn)進(jìn)行靶向片段刪除進(jìn)而進(jìn)行高通量功能性篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列位點(diǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)和存活密切相關(guān)。該研究首次發(fā)現(xiàn)該類增強(qiáng)子位點(diǎn)的刪除能夠改變大范圍染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過同時(shí)影響多個(gè)非必需基因表達(dá)所產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)來影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

由于目前能夠有效發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子互作的高分辨率Hi-C數(shù)據(jù)較少，本研究利用分辨率可達(dá)200-bp的EpiTensor算法，預(yù)測(cè)了73個(gè)正常細(xì)胞系和5個(gè)癌細(xì)胞系/組織中的活躍增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的三維互作，獲得了增強(qiáng)子與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子與增強(qiáng)子以及啟動(dòng)子與啟動(dòng)子的強(qiáng)烈互作位點(diǎn)hotspot。魏文勝合作團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)該調(diào)控元件互作網(wǎng)絡(luò)（Regulatory element interaction network，REIN）為小世界網(wǎng)絡(luò)，即對(duì)節(jié)點(diǎn)的隨機(jī)破壞不受影響但對(duì)于高度值節(jié)點(diǎn)的靶向破壞十分敏感（圖1A-B）。為了探究hotspot位點(diǎn)是否參與穩(wěn)定染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，合作團(tuán)隊(duì)利用實(shí)驗(yàn)室建立的CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的pgRNA片段刪除策略，在K562細(xì)胞中對(duì)選取的751個(gè)非編碼hotspot增強(qiáng)子位點(diǎn)進(jìn)行高通量功能性篩選，發(fā)現(xiàn)了43個(gè)影響細(xì)胞存活或增殖的重要功能區(qū)（稱為必需hotspot）（圖1C）。其中，hotspot_10_25（chr10: 74,123,469–74,1248,68）位點(diǎn)的刪除能夠?qū)е翶562細(xì)胞產(chǎn)生顯著的細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)抑制，而不影響其他多種癌細(xì)胞（圖1D）。

圖1 hotspot位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及高通量功能性篩選

為了探究hotspot位點(diǎn)刪除是否影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，合作團(tuán)隊(duì)選取hotspot_10_25位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究，該位點(diǎn)不與任何必需基因存在互作。Hi-C分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)刪除后其附近6–8 Mb區(qū)域的有效直徑（effectivediameter）和模塊化打分（modularityscore）發(fā)生顯著改變，并觀察到一些與該hotspot鄰近區(qū)域發(fā)生互作的區(qū)域（chr10: 11–17 Mb）也發(fā)生改變（圖2A-C）。與之相一致的是，在chr10: 12–14 Mb區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相關(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）發(fā)生破壞。這些染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致多個(gè)基因的增強(qiáng)子與啟動(dòng)子互作發(fā)生改變，包括CELF2, RSU1, FAM149B1和CCAR1等（圖2D），這些被影響的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子并不局限于被刪除的hotspot位點(diǎn)附近，甚至可以遠(yuǎn)達(dá)62 Mb。由此表明，hotspot位點(diǎn)的刪除可以影響大范圍染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而不限于其線性基因組的鄰近區(qū)域。單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該hotspot位點(diǎn)的刪除會(huì)激活一系列細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，并且可以同時(shí)影響TAD內(nèi)與之存在互作的多個(gè)非必需基因的表達(dá)，研究證明多基因表達(dá)改變的協(xié)同效應(yīng)能夠顯著影響細(xì)胞存活（圖2E）。該研究首次揭示了非編碼調(diào)控元件增強(qiáng)子在穩(wěn)定染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的重要性，而不局限于已知的通過增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的直接互作來進(jìn)行調(diào)控。

圖2 hotspot位點(diǎn)刪除導(dǎo)致大范圍三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和多基因表達(dá)的同時(shí)改變

值得一提的是，2021年11月，王巍和魏文勝兩個(gè)課題組合作在Science Advances上首次報(bào)道了無任何表觀遺傳信號(hào)的非編碼位點(diǎn)hub能夠穩(wěn)定染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)并維持細(xì)胞存活（Dingetal., Science Advances 2021）。通過對(duì)hub和hotspot這兩類非編碼位點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)性挖掘、高通量篩選及深入功能解析，將進(jìn)一步豐富對(duì)基因組非編碼區(qū)域的功能闡述，并逐步揭示其在維持三維基因組結(jié)構(gòu)中的重要作用。

北京大學(xué)劉瑩博士，加州大學(xué)圣地亞哥分校丁博博士、博士生鄭麗娜和北京大學(xué)許萍博士為該論文的共同第一作者，魏文勝和王巍為該論文的共同通訊作者。該研究項(xiàng)目得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市科委生命科學(xué)前沿創(chuàng)新培育項(xiàng)目、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、中國(guó)博士后科學(xué)基金、加州再生醫(yī)學(xué)研究所（CIRM）以及美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）的支持。

來源：北京大學(xué)