細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)的蛋白都經(jīng)蛋白酶體途徑降解。蛋白酶體全酶由桶狀的20S核心顆粒 (core particle, CP) 和1-2個(gè)調(diào)節(jié)顆粒 (regulatory particle, RP) 共同組成1，其底部為AAA (ATPase associated with diverse cellular activities) -ATPase，對(duì)底物在蛋白酶體中的降解起調(diào)節(jié)作用2。USP14是3種蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶 (deubiquitinating enzyme, DUB) 之一3，能與蛋白酶體發(fā)生可逆相互作用，且在作用后被活化4，且在蛋白酶體功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在早期的研究中，由于分辨率不足、結(jié)構(gòu)高度動(dòng)態(tài)等原因，USP14的蛋白全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)一直未被解析5-8，其對(duì)蛋白酶體的調(diào)節(jié)也未在原子水平被闡明。
2022年4月27日，北京大學(xué)毛有東團(tuán)隊(duì)在Nature上在線發(fā)表題為USP14-regulate allostery of the human proteosome by time-resolved cryo-EM的科研論文，利用深度學(xué)習(xí)強(qiáng)化的3D分類(lèi)方法解析了USP14-蛋白酶體復(fù)合物在決定底物命運(yùn)過(guò)程中一系列中間狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。本文所涉及的數(shù)據(jù)處理方法在此前Journal Club中已有介紹。
Nature | 利用深度學(xué)習(xí)強(qiáng)化的3D分類(lèi)闡明USP14對(duì)蛋白酶體功能的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)-肽度TIMEDOONature | 利用深度學(xué)習(xí)強(qiáng)化的3D分類(lèi)闡明USP14對(duì)蛋白酶體功能的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)-肽度TIMEDOO
為了得到結(jié)合底物的USP14-蛋白酶體復(fù)合物，作者分別純化了人源USP14、RPN13和26S蛋白酶體，將26S蛋白酶體與過(guò)量USP14、RPN13混合后，向體系中進(jìn)一步添加Ubn-SicPY作為模式底物，在含ATP或ATPγS的情況下孵育0.5、1、5和10min，隨后進(jìn)行冷凍樣品制備。發(fā)現(xiàn)在孵育1min時(shí)，整個(gè)體系中處于中間狀態(tài)的復(fù)合物比例最高（圖1）。進(jìn)一步對(duì)該樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和深度學(xué)習(xí)強(qiáng)化的3D分類(lèi)，最終得到3種EA-like (EA:泛素識(shí)別)、4種SD-like和6種ED-like (ED:進(jìn)行性降解) 的中間態(tài)構(gòu)象，分辨率為3.0 -3.6 ?。在所有處于ED-like狀態(tài)的結(jié)構(gòu)中，AAA-ATPase的孔道中均可以看到處于去折疊狀態(tài)的多肽底物，而在所有處于SD-like狀態(tài)的結(jié)構(gòu)中，孔道內(nèi)均無(wú)底物密度存在。此外，作者并未觀察到處于EB?(EB:去泛素化) 與EC?(EC:轉(zhuǎn)位起始) 兩種狀態(tài)的的復(fù)合物。USP14的UBL (ubiquitin-like) 結(jié)構(gòu)域通過(guò)以L70為中心的疏水界面與RPN1 T2位點(diǎn)互作。USP14與AAA-ATPase的OB (oligonucleotide- or oligosaccharide-binding) 結(jié)構(gòu)域以及AAA結(jié)構(gòu)域均存在相互作用。其與OB結(jié)構(gòu)域的互作主要由BL1 (blocking loop1)、BL2和BL3介導(dǎo)，這種互作在幾乎所有的SD-like和ED-like狀態(tài)中存在，USP結(jié)構(gòu)域在不同蛋白酶體狀態(tài)之間的擺動(dòng)可能是為了適應(yīng)AAA-ATPase的運(yùn)動(dòng)，從而維持與OB環(huán)的相互作用 (圖2)。相比之下，USP14與AAA結(jié)構(gòu)域的互作在不同狀態(tài)下存在差異。此外，結(jié)合結(jié)構(gòu)信息與生化數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)，泛素-USP-OB的互作在USP14的活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
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圖2. 蛋白酶體介導(dǎo)USP14的活化
Nature | 利用深度學(xué)習(xí)強(qiáng)化的3D分類(lèi)闡明USP14對(duì)蛋白酶體功能的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)-肽度TIMEDOO是底物進(jìn)行性降解過(guò)程中的一種中間狀態(tài)，在該狀態(tài)的結(jié)構(gòu)中，USP14與AAA結(jié)構(gòu)域存在相互作用，且AAA-ATPase RPT1亞基的兩個(gè)AAA subdomain之間的Walker A motif與ADP結(jié)合。而在其他USP14不與AAA結(jié)構(gòu)域互作的狀態(tài)中，核苷酸結(jié)合口袋中則沒(méi)有ADP或被ATP占據(jù)。結(jié)合后續(xù)生化實(shí)驗(yàn)，作者證實(shí)USP與AAA結(jié)構(gòu)域之間的相互作用對(duì)ATPase的活性發(fā)揮變構(gòu)調(diào)節(jié)作用（圖3）。
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圖3. USP-AAA互作界面
綜合本文所得到的結(jié)構(gòu)信息、動(dòng)力學(xué)和生化數(shù)據(jù)，作者對(duì)USP14調(diào)節(jié)蛋白酶體活性的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步闡述 (圖4)。USP14通過(guò)誘導(dǎo)蛋白酶體狀態(tài)轉(zhuǎn)變實(shí)現(xiàn)對(duì)其活性的調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)涉及到3個(gè)檢查點(diǎn)，分別為泛素化底物的識(shí)別、底物轉(zhuǎn)位起始以及泛素鏈的循環(huán)。在結(jié)合蛋白酶體的RPN1、RPT1亞基后，USP14活化，進(jìn)而識(shí)別被蛋白酶體募集的泛素化底物。USP14的結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致蛋白酶體朝兩個(gè)方向發(fā)生狀態(tài)轉(zhuǎn)變：1）RPN11占據(jù)底物進(jìn)入OB環(huán)的入口，導(dǎo)致底物無(wú)法插入AAA-ATPase的通道內(nèi)，USP14發(fā)揮DUB的功能，避免底物降解；2）如果RPN11縮窄但未完全封閉OB環(huán)，底物則插入AAA-ATPase的通道，進(jìn)而被蛋白酶體降解。
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圖4.USP14調(diào)節(jié)蛋白酶體功能的機(jī)制
綜上，本文利用深度學(xué)習(xí)強(qiáng)化3D分類(lèi)的方法，為具有高度和復(fù)雜動(dòng)態(tài)性的蛋白結(jié)構(gòu)的解析提供了新的思路。利用該方法，成功解析了USP14-蛋白酶體復(fù)合物工作周期中的一系列中間狀態(tài)，揭示了USP14調(diào)節(jié)蛋白酶體功能和參與決定底物命運(yùn)的潛在機(jī)制。
原文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04671-8
參考文獻(xiàn)
1. Mao, Y. In Macromolecular Protein Complexes III: Structure and Function (eds Harris J. R. &Marles-Wright, J.) Ch. 1 (Springer, 2021).2.? Dong, Y. et al. Cryo-EM structures and dynamics of substrate-engaged human 26S proteasome. Nature 565, 49–55 (2019).

3.? de Poot, S. A. H., Tian, G. & Finley, D. Meddling with fate: the proteasomal deubiquitinating enzymes. J. Mol. Biol. 429, 3525–3545 (2017).

4. Borodovsky, A. et al. A novel active site-directed probe specific for deubiquitylating enzymes reveals proteasome association of USP14. EMBO J. 20, 5187–5196 (2001).

5.? Bashore, C. et al. Ubp6 deubiquitinase controls conformational dynamics and substrate degradation of the 26S proteasome. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 712–719 (2015).

6.? Aufderheide, A. et al. Structural characterization of the interaction of Ubp6 with the 26S proteasome. Proc. Natl Acad. Sci. USA 112, 8626–8631 (2015).

7.? Huang, X., Luan, B., Wu, J. & Shi, Y. An atomic structure of the human 26S proteasome. Nat. Struct. Mol. Biol. 23, 778–785 (2016).

8.?Wehmer, M. et al. Structural insights into the functional cycle of the ATPase module of the 26S proteasome. Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, 1305–1310 (2017).

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