肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球約有180萬(wàn)人死于肺癌[1]。從組織病理學(xué)上，肺癌主要分為兩大類：小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要腫瘤類型，約占肺癌總數(shù)的84%。非小細(xì)胞肺癌又可以進(jìn)一步分為三個(gè)亞型：腺癌（ADC）、鱗癌（SCC）和大細(xì)胞癌（LCC），其中大細(xì)胞癌的主要亞型大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌（LCNEC）和小細(xì)胞肺癌都屬于神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NET）。已有的研究表明，腺癌、鱗癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌起源于不同類型的正常肺上皮細(xì)胞，具有不同的組織病理學(xué)特征和分子特征，對(duì)應(yīng)于不同的臨床治療方案[2]。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的突飛猛進(jìn)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于肺癌研究中，包括研究腫瘤組織的細(xì)胞組成、解析腫瘤免疫微環(huán)境的特征等，但是對(duì)于肺癌中腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性仍需進(jìn)一步闡釋，從而助力于腫瘤的個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療。

2022年8月13日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬教授團(tuán)隊(duì)與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院王潔教授團(tuán)隊(duì)、赫捷院士團(tuán)隊(duì)合作在Genome Medicine上發(fā)表了題為“Molecular profiling of human non-small cell lung cancer by single-cell RNA-seq”的研究論文。該研究利用高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)人類原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌的分子特征進(jìn)行了系統(tǒng)分析，在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平鑒定出一群全新的混合譜系腫瘤細(xì)胞并對(duì)其關(guān)鍵生物學(xué)特征展開了深入研究。

該研究有4個(gè)主要發(fā)現(xiàn)：

1.發(fā)現(xiàn)一類全新的混合譜系腫瘤細(xì)胞，并且這類混合譜系腫瘤細(xì)胞在所有非小細(xì)胞肺癌患者中普遍存在。

研究者利用高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自19例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌患者（14例腺癌、3例鱗癌、1例復(fù)合型小細(xì)胞肺癌、1例混合型腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌）和1例軟骨瘤型錯(cuò)構(gòu)瘤患者的癌旁組織和腫瘤組織的7,364個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。根據(jù)細(xì)胞類型特異性標(biāo)志基因的表達(dá)情況，鑒定出了6種主要細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓系細(xì)胞和肥大細(xì)胞。通過(guò)對(duì)其中來(lái)自16例患者的3,373個(gè)癌旁上皮和腫瘤上皮細(xì)胞進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)77.5%的腫瘤細(xì)胞會(huì)在同一個(gè)單細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)兩種甚至三種不同腫瘤亞型特異性的標(biāo)志基因（腺癌：NKX2-1、NAPSA、KRT7；鱗癌：TP63、KRT5、KRT6A；神經(jīng)內(nèi)分泌癌：CHGB、SYP、NCAM1)。該研究將這群細(xì)胞命名為混合譜系腫瘤細(xì)胞（圖1）。更重要的是，該研究所分析的所有16例患者的腫瘤樣本中均含有這類混合譜系腫瘤細(xì)胞（在不同患者的腫瘤組織中的比例為3.8%-100%），這說(shuō)明這類全新發(fā)現(xiàn)的混合譜系腫瘤細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌患者中是普遍存在的，很可能是所有非小細(xì)胞肺癌患者的共性特征。

圖1.肺癌不同腫瘤亞型標(biāo)志基因在上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況

以往基于10x Genomics平臺(tái)獲得的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，由于doubles率（雙細(xì)胞混雜率）和交叉污染率相對(duì)較高，常常很難鑒定出這種混合譜系腫瘤細(xì)胞。而該項(xiàng)研究使用的是基于STRT-seq改進(jìn)的高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，由于每個(gè)單細(xì)胞是研究者使用口吸管在高倍顯微鏡下精準(zhǔn)挑取的，只有完整且不粘連任何細(xì)胞碎片的單個(gè)細(xì)胞才會(huì)被挑取出來(lái)用于單細(xì)胞測(cè)序，因此獲得的數(shù)據(jù)精度非常高。在相對(duì)較少的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)量(每個(gè)患者只測(cè)序幾百個(gè)單細(xì)胞)中，就可以準(zhǔn)確地鑒定出混合譜系腫瘤細(xì)胞。進(jìn)一步，該研究使用多重RNA原位雜交和多重免疫熒光染色技術(shù)分別在RNA水平和蛋白水平在腫瘤組織切片上原位驗(yàn)證了這類混合譜系腫瘤細(xì)胞普遍存在（圖2）。

圖2.腺癌標(biāo)志基因NKX2-1和鱗癌標(biāo)志基因TP63在肺癌組織中的多重免疫熒光染色和多重RNA原位雜交情況

2.發(fā)現(xiàn)在同一個(gè)非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)的混合譜系腫瘤細(xì)胞和經(jīng)典的單譜系腫瘤細(xì)胞來(lái)自共同的腫瘤前體細(xì)胞。

混合譜系腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生可能和腫瘤細(xì)胞的異常分化有關(guān)，揭示同一個(gè)患者體內(nèi)的混合譜系腫瘤細(xì)胞和單譜系腫瘤細(xì)胞之間的起源關(guān)系，是理解混合譜系腫瘤細(xì)胞可塑性的基礎(chǔ)。為了研究同一個(gè)患者體內(nèi)的混合譜系腫瘤細(xì)胞和單譜系腫瘤細(xì)胞之間的起源關(guān)系，該研究使用了譜系追蹤的分析手段。過(guò)去常用的腫瘤細(xì)胞譜系追蹤手段包括遺傳標(biāo)記工具、單核苷酸變異（SNV），染色體拷貝數(shù)變異（CNV）和短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）變異等。近年來(lái)研究者們發(fā)現(xiàn)由于線粒體DNA（mtDNA）在單個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)多（～100-1000個(gè)拷貝），突變率相對(duì)核DNA高很多（～10-100倍）以及突變異質(zhì)性大等特點(diǎn)，線粒體突變可以作為體細(xì)胞譜系回溯的有效手段[3]。在該項(xiàng)研究中，研究者利用單細(xì)胞線粒體突變和染色體拷貝數(shù)變異（CNV）相結(jié)合的譜系追蹤分析手段對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)致分析，證實(shí)在同一個(gè)非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)，混合譜系腫瘤細(xì)胞和單譜系腫瘤細(xì)胞來(lái)自共同的腫瘤前體細(xì)胞，而不是各自獨(dú)立起源的（圖3）。這表明混合譜系腫瘤細(xì)胞的可塑性非常強(qiáng)，可能很容易在單譜系狀態(tài)和混合譜系狀態(tài)之間切換表型，這給非小細(xì)胞肺癌容易復(fù)發(fā)、容易耐藥的臨床特性提供了可能的解釋。

圖3.不同類型腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞線粒體突變和染色體拷貝數(shù)變異情況

由于該研究中測(cè)序細(xì)胞數(shù)和檢測(cè)到的線粒體突變位點(diǎn)有限，目前還不能明確混合譜系腫瘤細(xì)胞和單譜系腫瘤細(xì)胞的具體進(jìn)展方向，但研究者推測(cè)在一個(gè)非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)，最可能的是首先一種特定譜系的正常上皮細(xì)胞在早期癌變過(guò)程中轉(zhuǎn)化成了單譜系腫瘤細(xì)胞，然后其中一部分腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成混合譜系腫瘤細(xì)胞，獲得了更強(qiáng)的細(xì)胞可塑性。當(dāng)然這也不排除在腫瘤發(fā)展的后期，混合譜系腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化回單譜系腫瘤細(xì)胞狀態(tài)。這兩者之間的具體轉(zhuǎn)化方向未來(lái)還需要進(jìn)一步探究。此研究發(fā)現(xiàn)的混合譜系腫瘤細(xì)胞可能為研究非小細(xì)胞肺癌患者中不同腫瘤亞型之間的轉(zhuǎn)分化提供新的研究視角。

3.發(fā)現(xiàn)混合譜系腫瘤細(xì)胞的比例和特征與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。

混合譜系腫瘤細(xì)胞同時(shí)具有兩種甚至三種不同肺癌腫瘤亞型的分子特征，暗示其具有很強(qiáng)的細(xì)胞可塑性以及更高的基因表達(dá)程序紊亂，這很可能是非小細(xì)胞肺癌臨床治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的原因之一。為了進(jìn)一步研究混合譜系腫瘤細(xì)胞的比例和特征與患者預(yù)后的關(guān)系，研究者利用scRNA-seq數(shù)據(jù)鑒定出的腺癌、鱗癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌的標(biāo)志物，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌和肺鱗癌的大量細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行精細(xì)解析。根據(jù)三組腫瘤亞型標(biāo)志物的差異表達(dá)特征，將患者分成具有高混合譜系腫瘤細(xì)胞比例和特征組和低混合譜系腫瘤細(xì)胞比例和特征組。結(jié)合這些樣本的臨床信息，對(duì)兩組間的生存預(yù)后關(guān)系進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論對(duì)于肺腺癌還是肺鱗癌，具有高混合譜系特征的患者，相比于具有低混合譜系特征的患者，其總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期都明顯縮短（圖4）。這些結(jié)果表明混合譜系腫瘤細(xì)胞的比例和特征與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，進(jìn)一步提示對(duì)于具有高混合譜系特征的患者在臨床管理和治療中應(yīng)引起重視。

圖4.肺腺癌和肺鱗癌患者的生存曲線分析

4.鑒定出了混合譜系腫瘤細(xì)胞特異性高表達(dá)的一組標(biāo)志基因，并對(duì)其中的AKR1B1基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證。

該研究鑒定出了混合譜系腫瘤細(xì)胞相對(duì)于單譜系腫瘤細(xì)胞特異性高表達(dá)的73個(gè)標(biāo)志基因，其中包括細(xì)胞間質(zhì)相關(guān)基因FN1、TGFBI、COL1A1以及調(diào)控上皮細(xì)胞分化相關(guān)基因AKR1B1、SPRR1B以及角蛋白基因KRT6A、KRT19、KRT17等。值得注意的是，AKR1B1在四種混合譜系腫瘤細(xì)胞中都特異高表達(dá)（圖5a-b）。已有報(bào)道AKR1B1是多元醇代謝途徑的限速酶，并且可以通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）途徑促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，以及在肺癌和結(jié)直腸癌中通過(guò)EMT途徑使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞的特征，從而表現(xiàn)出細(xì)胞可塑性[4, 5]。因此，研究者猜測(cè)AKR1B1是混合譜系腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)可塑性的一個(gè)重要調(diào)控因子。通過(guò)在體外腫瘤細(xì)胞系和小鼠異種移植模型中對(duì)AKR1B1分別進(jìn)行siRNA敲降和使用小分子靶向藥物進(jìn)行蛋白功能抑制的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明AKR1B1基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，提示AKR1B1參與調(diào)控了混合譜系腫瘤細(xì)胞的可塑性（圖5c-h）。

圖5.混合譜系腫瘤細(xì)胞標(biāo)志基因AKR1B1的功能研究

綜上所述，該研究利用高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，深入分析了16例人類原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的分子特征，發(fā)現(xiàn)一類全新的混合譜系腫瘤細(xì)胞，這類混合譜系腫瘤細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌患者中廣泛存在。并進(jìn)一步證實(shí)在同一個(gè)非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)，混合譜系腫瘤細(xì)胞和單譜系腫瘤細(xì)胞來(lái)自共同的腫瘤前體細(xì)胞。這表明混合譜系腫瘤細(xì)胞的可塑性非常強(qiáng)，可能很容易在單譜系狀態(tài)和混合譜系狀態(tài)之間切換表型，這給非小細(xì)胞肺癌容易復(fù)發(fā)、容易耐藥的臨床特性提供了可能的解釋。該研究為非小細(xì)胞肺癌腫瘤亞型更為精準(zhǔn)的分型提供了新的線索，未來(lái)對(duì)于具有高混合譜系特征的非小細(xì)胞肺癌患者的診斷和治療具有重要的指導(dǎo)意義。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后李晴晴、汪睿博士、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院楊震林博士為該論文的并列第一作者。湯富酬教授與王潔教授、赫捷院士為該論文的共同通訊作者，此項(xiàng)研究得到了北京市高精尖創(chuàng)新中心、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)、北京市自然科學(xué)基金、教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃的支持。

參考文獻(xiàn)

1.Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F: Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin 2021, 71:209-249.

2.Chen Z, Fillmore CM, Hammerman PS, Kim CF, Wong KK: Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer 2014, 14:535-546.

3.Ludwig LS, Lareau CA, Ulirsch JC, Christian E, Muus C, Li LH, Pelka K, Ge W, Oren Y, Brack A, et al: Lineage Tracing in Humans Enabled by Mitochondrial Mutations and Single-Cell Genomics. Cell 2019, 176:1325-1339 e1322.

4.Wu X, Li X, Fu Q, Cao Q, Chen X, Wang M, Yu J, Long J, Yao J, Liu H, et al: AKR1B1 promotes basal-like breast cancer progression by a positive feedback loop that activates the EMT program. J Exp Med 2017, 214:1065-1079.

5.Schwab A, Siddiqui A, Vazakidou ME, Napoli F, Bottcher M, Menchicchi B, Raza U, Saatci O, Krebs AM, Ferrazzi F, et al: Polyol Pathway Links Glucose Metabolism to the Aggressiveness of Cancer Cells. Cancer Res 2018, 78:1604-1618.

來(lái)源：北京大學(xué)