2022年9月15日，北京大學生命科學學院季雄研究員課題組在Molecular Cell雜志在線發(fā)表了題為“Targeted protein degradation reveals RNA Pol II heterogeneity and functional diversity”的研究論文。該研究系統(tǒng)闡釋了真核生物細胞中RNA聚合酶II各亞基對轉錄和轉錄后過程的直接調控作用和潛在機制，首次表明RNA聚合酶II是一個優(yōu)化酶（Optimized polymerase, OPPO）, 其亞基在轉錄和轉錄后過程中發(fā)揮著不同甚至特異的作用。

論文截圖

RNA聚合酶II主要負責蛋白編碼基因的轉錄，是由12個亞基組成的蛋白復合體。領域內一直認為RNA聚合酶是作為一個整體發(fā)揮功能的全酶（holoenzyme），由于組成RNA聚合酶的亞基是必需基因，傳統(tǒng)干擾手段處理時間較長，不可避免地會引入二級效應，因此其亞基的直接調控功能不清楚而且被長期忽視。此外令人困惑的是，RNA聚合酶亞基應該是組成性表達的，但是其失調和變異常常會伴隨不同組織中的不同疾病，特別是腦部疾病。

研究者首先在小鼠胚胎干細胞中建立了RNA聚合酶II的12個亞基的瞬時降解細胞系，聯(lián)合染色質基因組與蛋白質組分別定量各個亞基的染色質互作基因組位點和蛋白質。結果顯示各亞基在基因組范圍內呈現(xiàn)非均一占位、互作蛋白存在顯著差異，例如RPB4與RPB7相較于其他亞基，其與轉錄延伸調控蛋白NELF復合物的互作強度明顯較低。結合定量質譜和分子篩生化分析，研究者同樣發(fā)現(xiàn)了各亞基在轉錄過程中呈現(xiàn)非均一的互作甚至可能存在從全酶解離的過程。

接著，研究者使用新生RNA測序實驗（PRO-Seq）探究各亞基瞬時降解后（1h）對新生RNA生成的影響。有趣的是，不同亞基的降解可產生不同程度的轉錄失衡，而一些亞基如RPB4、RPB9、RPB11、RPB12的降解不影響新生RNA生成，表明這些亞基瞬時降解后，不影響轉錄過程。與此同時，研究者繼續(xù)使用染色質RNA測序實驗（ChAR-Seq）對部分亞基降解后轉錄失衡現(xiàn)象進行了驗證，得出相同的結論，表明數(shù)據(jù)的可靠性。隨后，研究者通過WGCNA分析，將RNA聚合酶II復合物各亞基在染色質定位情況與降解后不同基因的轉錄情況進行了關聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)亞基在基因的結合強度越高，該基因的轉錄越依賴該亞基，暗示亞基對不同基因轉錄調控存在基因特異性。

為了進一步證實上述猜想，研究者開展了長時程降解（12h）后的PolyA-RNA-Seq實驗，探究各亞基對不同基因成熟mRNA的影響。研究者發(fā)現(xiàn)RPB1、RPB2、RPB5、RPB6、RPB7、RPB8的降解可導致大部分基因轉錄下降，表明這些亞基參與RNA聚合酶全酶穩(wěn)定性，這與免疫熒光成像實驗中這些亞基降解后導致核內全酶顯著降低的結果相呼應，然而RPB4和RPB12的降解在多個獨立實驗中均沒有呈現(xiàn)變化，研究者認為它們可能存在蛋白剪接變體代償了亞基降解的影響。有意思的是RPB3、RPB9、RPB10和RPB11的降解僅造成部分基因轉錄下降，免疫熒光成像實驗顯示延長降解時間，核內仍然保留部分RNA聚合酶II復合物，暗示這類亞基在全酶中起調控作用。

多學科實驗技術和生物信息學分析，系統(tǒng)闡釋了真核生物細胞中RNA聚合酶II各亞基對轉錄和轉錄后過程的直接調控作用

PolyA-RNA-Seq實驗結果同時顯示一些亞基降解后可導致部分基因不同程度的表達上調，研究者分析基因上調可能是轉錄后過程的失調造成的，如轉錄本3’末端加工缺陷、剪接加工缺陷等。使用前人開發(fā)的Dogfinder軟件，研究者鑒定出亞基降解前后存在轉錄通讀的基因類別，隨后結合基因3’末端加工系數(shù)的計算，發(fā)現(xiàn)RPB1、RPB3、RPB5、RPB8降解后可顯著增加轉錄通讀，這與Robert Roeder實驗室2020年在Molecular Cell發(fā)表文章發(fā)現(xiàn)RPB1-CTD降解后造成基因通讀的結果相吻合。同時研究者通過rMATs對轉錄剪接異常的基因進行鑒定，同樣發(fā)現(xiàn)不同亞基的降解可造成不同基因的剪接異常。更深入地，研究者對造成轉錄、轉錄后3’末端加工和剪接異常的潛在因素進行探索后，發(fā)現(xiàn)如DNA序列、RNA結合蛋白和RNA二級結構等多種因素參與決定亞基特異性的調控。

中國剪紙十二生肖代表RNA聚合酶II的12個亞基，占據(jù)在全酶復合體結構中的相對位置，構成了最吉祥的漢字“福”。該研究報道了12個亞基優(yōu)化RNA聚合酶II功能的基礎

RNA聚合酶亞基工作中，季雄是該論文的通訊作者，生命科學學院李圓君博士和黃捷博士是該論文的共同第一作者。北京大學生命科學學院博士研究生朱峻毅、包麗君，西湖大學生命科學學院郭天南、朱怡課題組等為該工作提供了重要幫助。

2022年9月16日，季雄課題組聯(lián)合北大定量生物學中心齊志研究員課題組在iScience雜志上發(fā)表了題為“CTCF DNA binding domain undergoes dynamic and selective protein–protein interactions”的研究論文，該文章揭示了CTCF的DNA結合結構域（DNA-binding Domain，DBD）能以不依賴無序結構域的方式形成動態(tài)的自聚集簇，在三維細胞核中能和絕緣子相關蛋白共聚集、和活躍轉錄因子不共定位，這一發(fā)現(xiàn)為解析CTCF的絕緣機制提供了一種全新的角度。

論文截圖

CTCF（CCCTC-binding factor）是脊椎動物體內目前已知的最主要的絕緣子結合蛋白，其可以阻斷增強子對啟動子的激活，抑制基因的表達，也可以作為“屏障”阻止異染色質的擴散。染色質構象捕獲技術結果顯示CTCF能促進染色質環(huán)結構的形成，通過與Cohesin形成染色質環(huán)，折疊成有助于增強子和啟動子互作的三維染色質構象。但在三維細胞核中CTCF如何阻礙染色質環(huán)內的增強子對環(huán)外基因啟動子的激活，以及CTCF的各個結構域和絕緣子功能有怎樣的關系鮮有報道。

研究者利用光誘導蛋白聚集的“optoDroplet”系統(tǒng)篩選到CTCF的DNA結合結構域能發(fā)生聚集；并在體外驗證CTCF的DBD能聚集形成動態(tài)的液滴；接下來研究者通過蛋白共定位分析結合活細胞追蹤成像，發(fā)現(xiàn)CTCF DBD的聚集能招募絕緣相關蛋白CHD8和BRD2，同時排開轉錄激活因子OCT4；通過對已發(fā)表的CTCF ChIP-Seq數(shù)據(jù)進行分析，研究者發(fā)現(xiàn)基因組上CTCF的基序越多，絕緣能力越強，并在表征絕緣活性的熒光素酶報告系統(tǒng)中插入不同數(shù)目的CTCF結合基序進行了驗證。鋅指結構是經典的結合核酸的蛋白結構域，為進一步探索核酸對CTCF DBD聚集的影響，研究者通過在體外相變體系加入核酸，在細胞實驗上利用破壞核酸結合能力的突變體等證明了核酸抑制CTCF DBD的聚集。此外，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)CTCF DNA結合結構域的精氨酸存在大量突變，該突變會影響CTCF DBD的DNA結合和絕緣能力。總之，研究者首次發(fā)現(xiàn)CTCF的DNA結合結構域可以發(fā)生自聚集，后續(xù)也驗證了其它轉錄因子例如BCL6、GATA3、YY1的DNA結合結構域也能形成聚集，并能和功能相關蛋白共定位，同時P53蛋白的DNA結合結構域內癌癥相關突變體R175H能降低其聚集體的穩(wěn)定性，這些結果表明，DNA結合結構域的聚集可能是一種較為普遍的轉錄因子的功能調控機制。

CTCF的DNA結合結構域能和絕緣相關蛋白發(fā)生動態(tài)和特異性的相互作用

CTCF絕緣機制工作中，季雄、齊志為本論文共同通訊作者。北京大學生命科學學院周蓉博士、田凱博士、黃捷博士為本論文共同第一作者。北京大學生命科學學院博士研究生段文嘉、付紅燁，上海科技大學生命科學與技術學院馬涵慧教授和馮穎等為該工作提供了重要幫助。這兩個工作得到科技部國家重點研發(fā)計劃、啟東創(chuàng)新基金、國家自然科學基金、北大-清華生命科學聯(lián)合中心和細胞增殖與分化教育部重點實驗室的資助。北京大學鳳凰工程多個儀器平臺對本項目提供了大力支持。

來源：北京大學