骨肉瘤（OS）是一種常見(jiàn)的惡性骨癌，發(fā)生在青春期和兒童期的概率最高。在臨床上，即使已經(jīng)有多種治療方法，包括手術(shù)、化療等，但是患者的5年生存率依然小于70％。主要的原因是由于腫瘤復(fù)發(fā)而引起的轉(zhuǎn)移和耐藥性。此外，有效的OS治療靶點(diǎn)或診斷標(biāo)志物尚未確定，因此難以改善患者的預(yù)后。因此，制定更好的戰(zhàn)略和發(fā)揮在那新的治療方法，以避免抵抗和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，才可以進(jìn)一步改善OS患者的預(yù)后。

最近來(lái)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院邵逸夫醫(yī)院骨科的研究人員于Molecular Cancer（IF= 7.776）上在線發(fā)表了題為CircFAT1 sponges miR-375 to promote the expression of Yes-associated protein 1 in osteosarcoma cells的研究，介紹了FAT1基因的2號(hào)外顯子形成的circFAT1在人骨肉瘤（OS）組織表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。機(jī)制上，circFAT1可以海綿miR-375，上調(diào)YAP1基因表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。該研究證明了circFAT1在骨肉瘤中的致瘤性，可能有望成為骨肉瘤治療的靶點(diǎn)。

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為了研究circFAT1對(duì)OS形成的影響，作者首先檢測(cè)了circFAT1在OS組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況。RT-qPCR和CISH實(shí)驗(yàn)顯示了在OS組織和細(xì)胞系中circFAT1的表達(dá)水平明顯上調(diào)。Sanger測(cè)序證明了circFAT1其實(shí)是FAT1基因的2號(hào)外顯子首尾拼接的產(chǎn)物。相比于FAT1 mRNA，circFAT1更耐受RNase R的消化。RT-PCR和northern blot實(shí)驗(yàn)證明了在HOS 和143B細(xì)胞系的確存在這種circFAT1。FISH實(shí)驗(yàn)表明circFAT1主要定位于胞漿。

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下一步，作者將研究circFAT1對(duì)OS細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)證明了在143B和HOS兩種骨肉瘤細(xì)胞中，敲低circFAT1表達(dá)可以明顯抑制細(xì)胞的增殖能力；FACS和WB實(shí)驗(yàn)證明了敲低circFAT1表達(dá)促進(jìn)OS細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了剪切型的caspase3 和PARP蛋白表達(dá)。克隆形成實(shí)驗(yàn)、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)則證明了敲低circFAT1表達(dá)明顯抑制了OS細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

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circFAT1表達(dá)水平明顯對(duì)于OS細(xì)胞的遷移和侵襲能力如此重要，那么其中的機(jī)制到底是什么？已被大量報(bào)道的circRNA功能主要是circRNA作為miRNA的海綿，調(diào)控其下游基因的表達(dá)。通過(guò)對(duì)doRiNA數(shù)據(jù)庫(kù)中AGO2免疫沉淀的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AGO2與circFAT1存在很高水平的結(jié)合，而且該結(jié)合區(qū)域序列在多種脊椎動(dòng)物中是屬于高度保守的。體外利用AGO2抗體進(jìn)行的免疫沉淀RNA，也發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性circFAT1的存在。通過(guò)對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)miRanda, Targetscan和RNAhybrid交叉預(yù)測(cè)了circFAT1可能結(jié)合的16種miRNA。利用biotin標(biāo)記的circFAT1探針進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，證明了在兩種OS細(xì)胞中，只有5種miRNA才可以結(jié)合circFAT1；luciferase reporter實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了miR-375明顯抑制含有circFAT1 3′-UTR的報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶的活性，可能主要是因?yàn)閏ircFAT1 包含miR-375的8mer-1a結(jié)合位點(diǎn)。RNA FISH實(shí)驗(yàn)則證明了circFAT1與miR-375在胞漿中的共定位。

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上一步的結(jié)果表明circFAT1 很有可能結(jié)合miR-375，那么miR-375在OS組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況是怎樣的？RT-qPCR和FISH實(shí)驗(yàn)顯示了在OS組織和細(xì)胞系中miR-375的表達(dá)水平明顯下調(diào)。過(guò)表達(dá)miR-375明顯抑制OS細(xì)胞的增殖，而促進(jìn)細(xì)胞的克隆形成能力、遷移和侵襲能力。抑制miR-375表達(dá)則減少細(xì)胞的凋亡，反向說(shuō)明miR-375可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

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????????miR-375與YAP1的關(guān)系：為了評(píng)估m(xù)iR-375在OS中發(fā)揮的功能，作者通過(guò)PicTar和TargetScan預(yù)測(cè)了miR-375很有可能與YAP1 mRNA的3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)；相比于軟骨瘤，骨肉瘤中YAP1的表達(dá)水平明顯上調(diào)；IHC結(jié)果說(shuō)明了在骨肉瘤組織中，YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表達(dá)明顯上調(diào)；luciferase reporter實(shí)驗(yàn)證明miR-375可抑制含有YAP1 3′-UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性，提示miR-375可以特異性靶向結(jié)合YAP1 3′-UTR；WB、RT-qPCR和FISH實(shí)驗(yàn)證明了抑制miR-375表達(dá)明顯上調(diào)YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表達(dá)，而miR-375過(guò)表達(dá)明顯抑制YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表達(dá)。重要的是，過(guò)表達(dá)YAP1明顯抑制OS細(xì)胞的凋亡。

????????miR-375與YAP1的功能聯(lián)系：接著作者猜測(cè)miR-375通過(guò)抑制YAP1表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤形成的能力。FISH實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK-8檢測(cè)增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)證明了miR-375過(guò)表達(dá)可明顯抑制YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移和侵襲能力，而當(dāng)同時(shí)過(guò)表達(dá)YAP1則會(huì)逆轉(zhuǎn)這些抑制效應(yīng)。給予miR-375 sponge抑制miR-375功能后明顯減少細(xì)胞的凋亡，而同時(shí)抑制YAP1表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

????????miR-375與circFAT1的功能聯(lián)系:?和上一步結(jié)果的實(shí)驗(yàn)相似，證明了敲低circFAT1表達(dá)明顯抑制了YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的蛋白和mRNA表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移和侵襲能力，而當(dāng)同時(shí)敲低miR-375表達(dá)則會(huì)逆轉(zhuǎn)這些抑制效應(yīng)。circFAT1過(guò)表達(dá)明顯減少細(xì)胞的凋亡，而同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-375則促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；

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????????circFAT1/miR-375/YAP1軸對(duì)于體內(nèi)OS細(xì)胞成瘤的影響：構(gòu)建的circFAT1敲除和/或miR-375 敲低的OS細(xì)胞在裸鼠成瘤后，發(fā)現(xiàn)敲除circFAT1明顯抑制體內(nèi)的成瘤，減少了瘤子體積，降低了瘤組織中YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表達(dá)；而同時(shí)敲低miR-375表達(dá)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的體內(nèi)成瘤，增加瘤子體積，上調(diào)YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表達(dá)水平。

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參考文獻(xiàn)

1. Liu G, et al. CircFAT1 sponges miR-375 to promote the expression of Yes-associated protein 1 in osteosarcoma cells. Mol Cancer. 2018 Dec 4;17(1):170. doi: 10.1186/s12943-018-0917-7.

來(lái)源：吉賽生物