近年來，CRISPR-Cas等新一代的基因編輯工具在腫瘤免疫治療和基因在體治療等過程中展現(xiàn)出了極大的應(yīng)用前景。基因編輯工具的優(yōu)化大概經(jīng)歷三個時期：一是編輯效率和應(yīng)用范圍的提高和拓展；二是脫靶活性的抑制；三是關(guān)注基因編輯的基因組毒性，其中主要指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變異。染色體結(jié)構(gòu)變異包括染色體易位和大片度DNA丟失¹。染色體結(jié)構(gòu)變異嚴重威脅基因組的穩(wěn)定性并干擾細胞的正常生命活動，進而促使細胞死亡、惡性增殖及癌變等，例如多種淋巴瘤和白血病均由染色體易位導(dǎo)致。2021年，NIH體細胞編輯項目組在Nature撰文，強調(diào)關(guān)注基因編輯導(dǎo)致的染色體結(jié)構(gòu)變異的重要性和必要性²。同年，因在輸注了通用型CAR-T細胞的病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了由基因編輯導(dǎo)致的染色體易位，美國FDA曾緊急叫停了由Allogene Therapeutics開發(fā)的CAR-T細胞療法的臨床研究³。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心胡家志研究員課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在用于腫瘤治療的通用型CAR-T細胞中，Cas9同時編輯多個位點將導(dǎo)致靶位點之間及靶位點與基因組其他位置之間產(chǎn)生高達2%左右的染色體易位，且可在體外培養(yǎng)2周過程中被持續(xù)檢測⁴。然而，基因編輯導(dǎo)致的T細胞染色體結(jié)構(gòu)異常在輸注至體內(nèi)后的命運仍是領(lǐng)域空白，這阻礙了基因編輯在臨床實踐中的大規(guī)模應(yīng)用，并成為持續(xù)懸在相關(guān)領(lǐng)域頭頂?shù)倪_爾摩斯之劍。

2022年10月16日，胡家志研究員課題組與北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院徐墨研究員課題組在Nucleic Acids Research在線發(fā)表了題為“CRISPR/Cas9-induced structural variations expand in T lymphocytes in vivo”的研究論文，全面、定量、長時程地追蹤分析了基因編輯導(dǎo)致的T細胞染色體結(jié)構(gòu)異常在輸注至小鼠體內(nèi)后的動態(tài)變化。該研究發(fā)現(xiàn)，基因編輯導(dǎo)致的染色體易位、染色體大片度丟失和病毒DNA插入在過繼給小鼠2個月內(nèi)，并不會隨著時間的延長而消失，而是持續(xù)維持在較高水平并展現(xiàn)出明確的隨機克隆擴增現(xiàn)象。尤其值得注意的是，部分結(jié)構(gòu)變異甚至可在體內(nèi)劇烈擴增至數(shù)萬個拷貝，初現(xiàn)惡性擴增的苗頭。

作者利用了徐墨課題組之前建立的小鼠腸炎模型⁵來研究過繼性T細胞中基因編輯導(dǎo)致的染色體結(jié)構(gòu)變異在體內(nèi)命運。在該體系中，僅表達特異識別Helicobacter hepaticus細菌抗原的TCR 的T細胞，首先在體外激活并被Cas9編輯。成功編輯的細胞將被輸注至已經(jīng)定植了Helicobacter hepaticus的免疫缺陷鼠中，進而誘發(fā)T細胞依賴的腸炎（圖一），該炎性過程與TCR-T或CAR-T細胞介導(dǎo)的腫瘤免疫治療高度類似。作者利用胡家志課題組前期開發(fā)高靈敏測序方法PEM-seq^1,6（Nucleic Acids Research | 胡家志課題組開發(fā)全面評估基因編輯產(chǎn)物新方法，詳細方案已于2022年發(fā)表在STAR protocols⁷），詳細追蹤并定量分析了Cas9編輯后的T細胞中的染色體結(jié)構(gòu)異常在輸注前、輸注3周和2個月后的比例及分布特點。

圖一. HH7-2tg小鼠模型模擬TCR-T細胞編輯和輸注治療過程

以危害性最大的染色體易位為例，作者發(fā)現(xiàn)，編輯后的T細胞在輸注前，其攜帶的染色體易位占總編輯事件的1%左右（圖二A），這與前期在人CAR-T細胞中的結(jié)果相當(dāng)⁴，并意味著在一次CAR-T細胞治療中，將至少有數(shù)百萬個攜帶染色體易位的T細胞被輸注入病人體內(nèi)。輸注入小鼠體內(nèi)3周和2個月后，染色體易位水平分別維持在0.2~3.36%（7只小鼠，僅有一只為3.36%，其他6只小鼠的最高水平為0.79%）和0.17~0.59%（4只小鼠）（圖二A），該發(fā)現(xiàn)糾正了領(lǐng)域內(nèi)前期用靈敏度和準確性有限的PCR做出的發(fā)現(xiàn)——染色體易位等結(jié)構(gòu)異常會隨著細胞生長而最終消失。此外，Cas9編輯后的T細胞中的染色體易位在輸注前相對均勻地分布于基因組上；而輸注至小鼠體內(nèi)3周或2個月后的T細胞中的染色體易位則主要由數(shù)個至數(shù)十個染色體易位事件組成，表明這些染色體易位隨著T細胞的增殖而出現(xiàn)了克隆擴增（該研究共發(fā)現(xiàn)128個克隆擴增的染色體易位）（圖二B）。尤其值得關(guān)注的是，作者在一只小鼠中發(fā)現(xiàn)編輯產(chǎn)生的染色體易位產(chǎn)生了20615個克隆（占所有染色體易位事件的72.2%），從而導(dǎo)致其染色體易位水平相比輸注前增高了2.4倍（圖二C），提示該染色體易位可能促使細胞獲得了一定的生長優(yōu)勢（圖二D）。

圖二. PEM-seq檢測炎癥T細胞中染色體易位的比例和高頻位點

與染色體易位類似，作者發(fā)現(xiàn)基因編輯導(dǎo)致的靶位點大片段DNA丟失和病毒DNA插入在輸注至小鼠體內(nèi)前后均分別維持在相近的水平，且表現(xiàn)出隨機克隆擴增的特點。同樣，作者在一只小鼠中發(fā)現(xiàn)一個病毒插入事件可產(chǎn)生30401個克隆，并導(dǎo)致其病毒DNA插入水平相比于輸注前增高了近2倍（圖三）。

圖三. PEM-seq鑒定炎癥T細胞中病毒DNA整合及單個病毒DNA位點所占比例

綜上，該研究發(fā)現(xiàn)基因編輯導(dǎo)致的染色體易位、靶位點的大片段DNA缺失和病毒DNA插入等嚴重危害基因組穩(wěn)定性的副產(chǎn)物，在輸入至小鼠體內(nèi)后的2個月內(nèi)，不僅不會消失，反而在每只接受輸注的小鼠（共計16只）中均有部分染色體結(jié)構(gòu)異常發(fā)生了劇烈的隨機克隆擴增。不僅如此，相比于輸注前，該研究在4只（25%）接受輸注的小鼠中檢測到了更高水平的染色體易位，提示攜帶有染色體結(jié)構(gòu)異常的T細胞的異常增殖可能會高頻發(fā)生。因此，該研究不僅為淋巴瘤或白血病中致癌性染色體易位在體內(nèi)的發(fā)展歷程提供了啟示，而且還提示了采用PEM-seq等方法持續(xù)追蹤檢測基因編輯依賴的過繼性細胞療法（如通用型CAR-或TCR-T，基因編輯后的HSC或胰島細胞等）或在體基因治療（黃斑病變等）中基因編輯產(chǎn)物在體內(nèi)動態(tài)變化及命運的必要性。此外，該研究還啟示使用更安全基因編輯工具的必要性，如可將染色體結(jié)構(gòu)異常降低至背景水平的Cas9TX等⁴（NatureCommunications | 胡家志研究組開發(fā)目前最安全的Cas9基因編輯工具變體Cas9TX）。

胡家志、課題組劉陽博士和徐墨為該文章的共同通訊作者。胡家志課題組博士研究生吳錦淳，徐墨課題組博士研究生鄒梓曄以及劉陽為該文章的共同第一作者，胡家志課題組博士研究生劉栩豪和張丁崢嶸在該工作中亦有重要貢獻。該工作得到了中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、科技部國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、細胞增殖與分化教育部重點實驗室、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院儀器中心(成像平臺及流式平臺)、北京生命科學(xué)研究所/清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院以及北京市科委的大力支持。

參考文獻：

1.Liu, M. et al. Global detection of DNA repair outcomes induced by CRISPR–Cas9. Nucleic Acids Research 49, 8732-8742, doi:10.1093/nar/gkab686 (2021).

2. Saha, K. et al. The NIH Somatic Cell Genome Editing program. Nature 592, 195-204, doi:10.1038/s41586-021-03191-1 (2021).

3. Sheridan, C. Off-the-shelf, gene-edited CAR-T cells forge ahead, despite safety scare. Nat Biotechnol 40, 5-8, doi:10.1038/d41587-021-00027-1 (2022).

4. Yin, J. et al. Cas9 exo-endonuclease eliminates chromosomal translocations during genome editing. Nat Commun 13, 1204, doi:10.1038/s41467-022-28900-w (2022).

5. Xu, M. et al. c-MAF-dependent regulatory T cells mediate immunological tolerance to a gut pathobiont. Nature 554, 373-377, doi:10.1038/nature25500 (2018).

6. Yin, J. et al. Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing. Cell discovery 5, 1-11, doi: 10.1038/s41421-019-0088-8 (2019).

7. Liu, Y. et al. PEM-seq comprehensively quantifies DNA repair outcomes during gene-editing and DSB repair. STAR Protocols 3, 101088, doi:https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.101088 (2022).

消息來源：北京大學(xué)