黏連蛋白Cohesin介導(dǎo)細(xì)胞分裂過程中姐妹染色體的黏連，還參與染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的形成和維持¹，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的穩(wěn)定性有著非常重要的影響。黏連蛋白的失活突變?cè)诙喾N癌癥中高頻出現(xiàn)，但前期的研究表明黏連蛋白功能缺失導(dǎo)致的姐妹染色體黏連錯(cuò)亂引起的染色體非整倍性可能不是致癌的主要原因²，這表明黏連蛋白功能缺失導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定乃至腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步挖掘。

2023年7月27日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心胡家志研究員課題組在Nature Genetics發(fā)文揭示了黏連蛋白Cohesin功能缺失導(dǎo)致致癌基因突變的分子機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)黏連蛋白缺失會(huì)導(dǎo)致休眠復(fù)制源在S期早期的大量激活，從而干擾正常的DNA復(fù)制時(shí)序，進(jìn)而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性的劇增，從而引起部分致癌或者抑癌基因的突變。該研究是本課題組轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)DNA復(fù)制起始的工作的延續(xù)，也拓展了他們對(duì)基因組三維結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)DNA復(fù)制而維持基因組穩(wěn)定性的分子機(jī)制的理解，還糾正了領(lǐng)域內(nèi)早前部分研究認(rèn)為黏連蛋白失活不影響DNA復(fù)制時(shí)序的錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)。

圖1 RAD21降解造成大量基因組雙鏈斷裂發(fā)生。（a)染色質(zhì)loop及Cohesin復(fù)合體示意圖。（b）K562細(xì)胞中RAD21 AID蛋白降解體系構(gòu)建與驗(yàn)證。1#和4#為構(gòu)建成功的RAD21-mAID-mClover細(xì)胞系，簡(jiǎn)稱RAD21-mAC。（c）PEM-seq方法從MYC和TP53位點(diǎn)分別檢測(cè)RAD21降解后染色體易位頻率。（d）RAD21降解導(dǎo)致的DSB熱點(diǎn)基因。（e）TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)子宮內(nèi)膜癌樣本中熱點(diǎn)基因與Cohesin蛋白亞基共突變情況

為探究黏連蛋白失活的影響，作者在人K562免疫細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞中構(gòu)建了生長(zhǎng)素介導(dǎo)的Degron系統(tǒng)，用以快速降解黏連蛋白Cohesin的核心組分之一——RAD21（圖1a）。與之前報(bào)道一致，該系統(tǒng)只能部分降解RAD21（~70%）。為排除RAD21未降解細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，作者僅分選RAD21徹底降解的細(xì)胞用于后續(xù)分析（圖1b），而之前的兩項(xiàng)相關(guān)研究均未排除這部分細(xì)胞的影響，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成了干擾。作者首先采用實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的檢測(cè)DNA雙鏈斷裂的高通量測(cè)序方法——PEM-seq³進(jìn)行定量分析（Cell Discovery | 胡家志研究組開發(fā)出優(yōu)化基因編輯和追蹤DNA修復(fù)的新方法），發(fā)現(xiàn)RAD21缺失將導(dǎo)致全基因組的DNA斷裂水平提高至原來的3—5倍（圖1c）。這說明黏連蛋白在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著極為重要的作用。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)RAD21缺失導(dǎo)致的DNA斷裂富集于147個(gè)熱點(diǎn)基因，其中超過三分之一與癌癥和其它疾病高度相關(guān)（圖1d）。此外，這些熱點(diǎn)損傷基因與黏連蛋白的失活存在顯著共突變的關(guān)系（圖1e），這表明黏連蛋白的失活突變可能是相關(guān)癌癥或疾病發(fā)生發(fā)展的核心原因之一。通過分析這些DNA損傷的分布位置發(fā)現(xiàn)，染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的改變和轉(zhuǎn)錄水平的輕微擾動(dòng)不是黏連蛋白降解導(dǎo)致DNA損傷的主要原因。但作者發(fā)現(xiàn)RAD21降解導(dǎo)致的DNA損傷非對(duì)稱性地分布于DNA雙鏈，且該非對(duì)稱分布與DNA復(fù)制過程中后隨鏈的關(guān)鍵產(chǎn)物——岡崎片段的分布方向一致（圖2a）。此外，黏連蛋白的降解還導(dǎo)致DNA復(fù)制速率下降且停頓復(fù)制叉增多（圖2b、c），這些數(shù)據(jù)均表明黏連蛋白與DNA復(fù)制的穩(wěn)定有著重要的關(guān)系，其缺失可能通過影響DNA復(fù)制而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性。目前已知DNA復(fù)制是細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性最大的來源。作者通過繪制細(xì)胞的DNA復(fù)制時(shí)序，發(fā)現(xiàn)黏連蛋白的降解導(dǎo)致了約30%基因組區(qū)域的DNA復(fù)制時(shí)序提前（圖2d、e），且DNA損傷的熱點(diǎn)基因大多位于DNA復(fù)制時(shí)序異常的區(qū)域（圖2f）。

圖2 RAD21降解導(dǎo)致復(fù)制時(shí)序紊亂和復(fù)制壓力。（a）PEM-seq檢測(cè)RAD21降解后細(xì)胞中染色體易位斷裂位點(diǎn)偏向性與OK-seq相似。（b）RAD21降解導(dǎo)致復(fù)制叉速率減慢。（c）RAD21降解導(dǎo)致復(fù)制叉停頓增加。（d）RAD21降解導(dǎo)致部分基因組區(qū)域復(fù)制時(shí)序提前。（e）K562細(xì)胞基因組中31.6%的區(qū)域在RAD21降解后發(fā)生復(fù)制時(shí)序的顯著提前。（f）熱點(diǎn)基因的復(fù)制時(shí)序變化情況，每個(gè)方格表示一個(gè)基因，紅色和藍(lán)色分別表示復(fù)制時(shí)序的提早和延遲

為探究復(fù)制時(shí)序改變的原因，作者采用了該實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的用于鑒定DNA復(fù)制起始的測(cè)序方法——NAIL-seq⁴（Genome Biology | 胡家志實(shí)驗(yàn)室揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)DNA復(fù)制起始的分子機(jī)制），發(fā)現(xiàn)RAD21的降解導(dǎo)致約25%更多的DNA復(fù)制源在S期早期被激活（圖3a、b）。這些早期復(fù)制起始位點(diǎn)具有經(jīng)典復(fù)制源的特征，為休眠復(fù)制源（dormant origins）。這些在早期被異常激活的復(fù)制源導(dǎo)致了DNA復(fù)制時(shí)序的提前（圖3c）。休眠復(fù)制源在正常情況下只在DNA復(fù)制中晚期偶爾起始，只有在面臨DNA復(fù)制壓力時(shí)才會(huì)大量激活。而休眠復(fù)制源在S期早期的提前激活需要消耗更多的復(fù)制相關(guān)因子，從而引起復(fù)制壓力，這可能是RAD21缺失導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性的重要原因之一。定點(diǎn)敲除c-MYC基因附近的染色質(zhì)環(huán)的錨點(diǎn)，將導(dǎo)致染色質(zhì)環(huán)內(nèi)部作用的減弱，從而引起DNA復(fù)制起始在染色質(zhì)環(huán)內(nèi)部的激活，并進(jìn)而引起DNA損傷水平的增加（圖3d）。這些數(shù)據(jù)揭示了Cohesin缺失→DNA復(fù)制起始位點(diǎn)增加→DNA復(fù)制時(shí)序紊亂→DNA損傷水平上升的邏輯關(guān)系，為深入理解黏連蛋白Cohesin在DNA復(fù)制過程中的功能提供了更多的解釋。

圖3 RAD21降解導(dǎo)致復(fù)制起始位點(diǎn)增加并引起DNA雙鏈斷裂。（a）RAD21降解后（4#）NAIL-seq檢測(cè)到的早期復(fù)制起始信號(hào)（EdU/HU）和所鑒定的早期復(fù)制起始位點(diǎn)（Early replication initiation zones, ERIZs）。(b)餅圖統(tǒng)計(jì)1#和4#RAD21-mAC細(xì)胞中RAD21降解后ERIZ信號(hào)強(qiáng)度分類和比例。（c）K562中四類ERIZ區(qū)域在RAD21未降解和降解的細(xì)胞中所處的復(fù)制時(shí)序密度圖。（d）c-MYC區(qū)域染色質(zhì)環(huán)錨定位點(diǎn)的敲除（綠色方塊）造成橙色陰影區(qū)域染色質(zhì)相互作用（q3C-seq）減弱，早期復(fù)制起始信號(hào)（NAIL-seq）增強(qiáng)和DSB（END-seq）的增加

胡家志為通訊作者。前沿交叉學(xué)科研究院2023屆博士畢業(yè)生吳錦淳、生命科學(xué)學(xué)院博士后劉陽(yáng)博士、生命科學(xué)學(xué)院2021級(jí)博士研究生張丁崢嶸和劉栩豪為共同第一作者。艾晨博士、甘婷婷博士、梁昊昕、郭岳峰、陳莫晗、尹健行博士、劉懿陽(yáng)和張微微博士亦有貢獻(xiàn)。該工作得到了科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金、細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、生命科學(xué)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院儀器平臺(tái)以及鳳凰中心的大力支持。

原文鏈接：https://rdcu.be/dhUmX

1.Rao, S.S.P., Huang, S.-C., Glenn St Hilaire, B., Engreitz, J.M., Perez, E.M., Kieffer-Kwon, K.-R., Sanborn, A.L., Johnstone, S.E., Bascom, G.D., Bochkov, I.D., et al. (2017). Cohesin Loss Eliminates All Loop Domains. Cell 171, 305-320.e324.

2.Waldman, T. (2020). Emerging themes in cohesin cancer biology. Nature Reviews Cancer 20, 504-515.

3.Yin, J., Liu, M., Liu, Y., Wu, J., Gan, T., Zhang, W., Li, Y., Zhou, Y., and Hu, J. (2019). Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing. Cell discovery 5, 1-11.

4.Liu, Y., Ai, C., Gan, T., Wu, J., Jiang, Y., Liu, X., Lu, R., Gao, N., Li, Q., and Ji, X. (2021). Transcription shapes DNA replication initiation to preserve genome integrity. Genome biology 22, 1-27.

來源：北京大學(xué)