去甲腎上腺素 (Norepinephrine 或 noradrenaline；NE) 、多巴胺 (Dopamine；DA)和血清素 (Serotonin ；或5-羥色胺5-hydroxytryptamine, 5-HT) 是重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，影響著包括運動、激素分泌、獎懲和情緒相關(guān)的復(fù)雜行為和生理過程。這些神經(jīng)遞質(zhì)在突觸前膜去極化后釋放到突觸間隙，隨后激活突觸后膜上的受體并觸發(fā)影響神經(jīng)元興奮性、突觸可塑性和各種生理過程的細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)。正常生理情況下，從突觸前神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，在完成信號傳導(dǎo)后必須及時高效地從突觸間隙被清除，從而實現(xiàn)信號終止。通過突觸前神經(jīng)元或者神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)膜上的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白（Monoamine transporters; MATs），可以將單胺類神經(jīng)遞質(zhì)再攝取回突觸前膜從而終止其對下游受體的激活狀態(tài)。目前，MATs家族抑制劑主要在醫(yī)藥市場上用作抗抑郁藥，可根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用方式分為不同的類別（圖1）。
圖1. 單胺能神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞過程及不同抗抑郁藥物的作用方式1MATs屬于神經(jīng)遞質(zhì)鈉同向轉(zhuǎn)運蛋白（Neurotransmitter: sodium symporter; NSS）家族成員，其利用膜外/內(nèi)鈉離子Na+的濃度梯度來完成對神經(jīng)遞質(zhì)的同向跨膜運輸，這一過程可能依賴于氯離子Cl–同向轉(zhuǎn)運以及鉀離子K+的反向轉(zhuǎn)運。近年來對MATs 中底物轉(zhuǎn)運及抗抑郁藥物調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展迅速，其中果蠅多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白dDAT和人源血清素轉(zhuǎn)運蛋白SERT的不同構(gòu)象以及與多種抗抑郁藥物分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析。但關(guān)于人源去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白NET的結(jié)構(gòu)研究相對進(jìn)展緩慢，這大大阻礙了抗抑郁藥物的進(jìn)一步優(yōu)化和開發(fā)。
2024年7月24日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心閆創(chuàng)業(yè)/袁亞飛團(tuán)隊在《自然》（Nature）雜志發(fā)表了題目為“人類去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白再攝取與抑制分子基礎(chǔ)” （Molecular basis of human noradrenaline transporter reuptake and inhibition）的研究論文。該工作通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)方法闡明了NET轉(zhuǎn)運底物NE和DA的機(jī)制，首次報道了NET中的第二個底物結(jié)合位點和NSS家族的鉀離子結(jié)合位點，揭示了四種不同類別的常用上市抗抑郁藥物的選擇性抑制機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)靶向MATs的藥物奠定了基礎(chǔ)。
該團(tuán)隊利用冷凍電鏡技術(shù)成功解析了人源NET蛋白的八個高分辨率結(jié)構(gòu)，包括天然狀態(tài)、結(jié)合底物（NE、DA）和四種常用上市抗抑郁藥物（托莫西汀：Atomoxetine，ATX；地昔帕明 ：Desipramine，DSP；艾司西酞普蘭：Escitalopram，ESC；安非他酮：Bupropion，BPP）的結(jié)合狀態(tài)。這些結(jié)構(gòu)是天然蛋白在未使用任何基準(zhǔn)標(biāo)記或突變的情況下獲得，分辨率在2.5到3.5埃之間（圖2）。
圖2. 人源NET天然狀態(tài)、結(jié)合兩種底物和四種抗抑郁藥物復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
研究發(fā)現(xiàn) NET中央口袋S1處識別NE或DA的方式與報道的果蠅dDAT不同，其兒茶酚環(huán)上的兩個羥基主要通過水介導(dǎo)的氫鍵識別 （圖3a，b）。此外，研究在NET與兩種底物結(jié)合的結(jié)構(gòu)中都觀測到了第二個底物的密度（S2位點）。值得注意的是，與已報道的SERT中的S2位點顯著不同2，NET中的S2位點位于TM1b C末端，且僅存在于向內(nèi)閉合或開放的構(gòu)象中，向外開放構(gòu)象轉(zhuǎn)變會導(dǎo)致S2位點被破壞 （圖3c）。通過生化實驗發(fā)現(xiàn)，S2位點內(nèi)的某些突變顯著影響轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運速度。推測NET中S2位點的功能可能是提前加載底物，從而加快底物轉(zhuǎn)運效率。
圖3. ?NET中心口袋S1的底物結(jié)合方式（a-b）、S2位點（c）及K+離子結(jié)合位點（d）
MATs成員是離子耦合的膜蛋白，作為次級主動轉(zhuǎn)運蛋白，它們共享兩個保守的Na+結(jié)合位點（Na1和Na2）和一個保守的Cl–結(jié)合位點，利用跨膜離子梯度的能量來催動神經(jīng)遞質(zhì)的運輸 （圖3a）。早在1979年時K+離子就被提出參與MATs的轉(zhuǎn)運循環(huán)，但直到現(xiàn)在實驗結(jié)構(gòu)仍未確定特定的K+結(jié)合位點3。研究人員在向內(nèi)開口的NET-DSP-KCl結(jié)構(gòu)的 Na1 位點處發(fā)現(xiàn)了K+的額外密度，而該密度在 NaCl 條件下的NET內(nèi)向開口構(gòu)象中并不存在。據(jù)此，該研究首次通過結(jié)構(gòu)驗證了NSS 家族中 K+ 離子的結(jié)合位點。這一K+ 離子位點恰好是Na1位點，該位點在向內(nèi)開口釋放Na+離子之后，局部殘基構(gòu)象發(fā)生改變，使得該位點更偏好螯合K+離子（圖3d）。盡管確認(rèn)了 Na1 處 K+ 的存在及其在運輸中的作用，但其觸發(fā)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的確切機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。
深入了解不同抗抑郁藥物對MATs的選擇性抑制的分子基礎(chǔ)對于抗抑郁藥物的開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。托莫西汀是一種NE再攝取抑制劑（NRI），其對 NET 的選擇性比 SERT 和 DAT 高約 30 倍和 130 倍；地昔帕明是三環(huán)類抗抑郁藥（TCA），其對NET的選擇性比SERT高約20倍；安非他酮是典型的NE和DA再攝取抑制劑（NDRI）；而艾司西酞普蘭是一種典型的選擇性血清素再攝取抑制劑（SSRI），其對SERT的選擇性比NET高約2600倍。該研究通過解析四種不同類型的抗抑郁藥物的高分辨率結(jié)構(gòu)，為理解其對NET、DAT和SERT選擇性提供了分子基礎(chǔ)。通過不同抑制劑濃度的[3H]-NE攝取測定，該研究進(jìn)一步揭示了托莫西汀的競爭性抑制及其它三種抑制劑的混合型抑制機(jī)制與結(jié)合不同構(gòu)象相關(guān)。這些研究為理解靶向MATs的抗抑郁藥物選擇性提供了重要見解，MATs抗抑郁藥獨特的結(jié)合模式和多靶點特性值得制藥行業(yè)特別關(guān)注。
綜上，研究人員提出了NET的轉(zhuǎn)運過程模型（圖4）。在向外開放的構(gòu)象中，Na+、Cl–和底物NE與中央口袋結(jié)合，啟動 NET 的閉合，進(jìn)入閉合狀態(tài)。在這個轉(zhuǎn)變過程中，第二個底物可以提前結(jié)合到新形成的膜外S2位點中。隨后，TM1a 的打開（向內(nèi)開放構(gòu)象的標(biāo)志特征）促進(jìn)底物與兩個Na+一起從中央口袋釋放。在轉(zhuǎn)變回向外開放構(gòu)象的過程中，S2 位點的局部結(jié)構(gòu)將受到破壞，導(dǎo)致S2位點處底物的釋放。釋放的底物可能直接進(jìn)入到中央口袋，開始下一個轉(zhuǎn)運循環(huán)。這一過程與兩個 Na+ 離子和一個 Cl– 離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)以及可能一個 K+ 離子進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)的轉(zhuǎn)運耦合。而不同類別的抗抑郁藥物占據(jù) S1 位點阻礙底物轉(zhuǎn)運。
圖4. ?NET的交替開放轉(zhuǎn)運模型和抑制機(jī)制
首次發(fā)現(xiàn)了NET的第二個底物結(jié)合位點以及NSS家族的K+結(jié)合位點，揭示了NET底物識別機(jī)制、交替開放轉(zhuǎn)運模型、以及不同類別抗抑郁藥物選擇性抑制的分子機(jī)制，為抗抑郁藥物的進(jìn)一步研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心副教授閆創(chuàng)業(yè)和助理研究員袁亞飛為本文共同通訊作者；2019級博士畢業(yè)生譚佳鑫，2021級博士生肖媛和孔方為本文的共同第一作者。清華大學(xué)藥學(xué)院田博學(xué)副教授以及張孝春博士生對S2位點底物結(jié)合進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬。實驗室成員徐翰文、朱盎岐博士以及柳奕名對本研究提供了重要幫助。清華大學(xué)冷凍電鏡平臺主管雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。實驗的電鏡數(shù)據(jù)采集受到清華大學(xué)冷凍電鏡平臺的支持，實驗的計算工作得到清華大學(xué)高性能計算平臺、國家蛋白質(zhì)設(shè)施實驗技術(shù)中心（北京）的支持。本研究獲得了北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心與清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心的經(jīng)費支持。
https://doi.org/10.1038/s41586-024-07719-z
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