自2012年“魔剪”技術出道以來，該技術一直備受爭議。一些專家指出，基因編輯在很多層面上難以實現(xiàn)控制。近年來，科學家一直致力于開發(fā)“抗CRISPR”系統(tǒng)，來干擾細胞中的Cas核酸酶功能，以此來給CRISPR基因編輯技術帶上一定程度的“鐐銬”，規(guī)范該技術的使用操作。

如今，在美國Broad研究所開發(fā)的高通量檢測方法下，這一“抗CRISPR”系統(tǒng)迎來了第一位成員：SpCas9(化膿性鏈球菌 Cas9)的小分子抑制劑。相關研究已經(jīng)發(fā)表在《Cell》雜志上。

DOI：https ：//doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.009

CRISPR-Cas9與SpCas9

最新研究表明，許多基因工程技術的實施都需要依賴準確地CRISPR-Cas9系統(tǒng)進行有效控制才能保證基因編輯的準確有效性。而Cas9在CRISPR基因編輯技術中作為最常用DNA切割酶，十分容易引起基因組的改變。我們發(fā)現(xiàn)它在細菌的膿性鏈球菌 Cas9（SpCas9）上存在量較多。

目前SpCas9正被開發(fā)為多種疾病的基因治療藥物，包括HIV、視力障礙、肌肉萎縮癥和其他遺傳性疾病等。然而，治療中不斷高發(fā)的脫靶效應、染色體易位、基因毒性等副作用，讓治療手段尤其是對SpCas9的治療劑量和時間的調(diào)控變得尤為重要。

來自美國Broad研究所的Amit Choudhary博士及其同事最終也將“抗CRISPR”的研究目光也鎖定在Cas9的最初來源的膿性鏈球菌 Cas9（SpCas9）上。同時，他們通過一系列生化和細胞水平的測定，篩選出針對SpCas9的小分子抑制劑，使得對“抗CRISPR-Cas9”基因編輯系統(tǒng)有了更加行之有效的控制。

Amit Choudhary博士 圖片來源：Vilcek Foundation

SpCas9小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)

在此研究之前，科學家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白的存在，但這類蛋白體積很大，而且不易被細胞滲透，在作用中不可逆轉，還存在可能被蛋白酶降解的風險，甚至可能在哺乳動物體內(nèi)造成不良免疫反應的風險。

因此，在此研究中，研究人員選取小分子作為“抗CRISPR”蛋白的新型對象，篩選出一組多樣化的小分子，通過識別化合物結構來破壞SpCas9與DNA的結合，從而達到干擾SpCas9對DNA進行切割的作用。

高通量初級和二級分析

研究人員還發(fā)現(xiàn)，這些小分子抑制劑可以穩(wěn)定地進入細胞，且比先前發(fā)現(xiàn)的一些抗CRISPR蛋白要小的多，同時這樣的小分子抑制劑能夠?qū)pCas9實現(xiàn)行動可逆，劑量可控，相對穩(wěn)定且溫和的控制。這樣的“抗CRISPR蛋白”抑制劑的發(fā)現(xiàn)，對應用于哺乳動物細胞的基因編輯，堿基編輯，和表觀遺傳編輯具有重要意義。

SpCas9的小分子抑制劑的鑒定和驗證

Amit Choudhary博士對此項研究評價道：“這些研究結果為精確控制CRISPR-Cas9活性奠定了基礎。然而，這些分子抑制劑目前還沒有在生物體內(nèi)進行有效性測試，距離人類應用還有很長一段路要走。”

接下來，研究人員將致力于兩個方向的研究：第一，確定這類抑制劑在SpCas9：gRNA復合物上的結合位點，并檢查其作用機制，優(yōu)化其效力。第二，確定這類分子抑制劑能否作用于哺乳動物細胞中的其他靶標，并評估它們對其他CRISPR相關核酸酶的特異性。

參考文獻：

[1] A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9

[2] CRISPR Under Control: Small-Molecule Inhibitors of Cas9 Identified

[3] Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy

來源：生物探索