近日，中科院神經(jīng)科學研究所徐進課題組以“重新激活無義介導的mRNA降解通路可有效對抗C9orf72雙肽重復(fù)序列的神經(jīng)毒性”為題，在期刊Brain（IF=10.8）發(fā)表了一篇關(guān)于肌萎縮側(cè)索硬化癥的最新研究。在這項研究中，安諾基因承擔轉(zhuǎn)錄組測序工作。

肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種嚴重的神經(jīng)退行性疾病，目前沒有有效的治療方法。在我國通常將肌萎縮側(cè)索硬化癥與運動神經(jīng)元病混用，俗稱漸凍人癥。一旦確診，患者多在3-5年內(nèi)去世，著名的物理學家霍金就曾遭受此疾病的困擾。目前對這種疾病有效的干預(yù)治療的研究情況是什么樣的呢？小編帶大家一看究竟吧~

研究亮點

研究發(fā)現(xiàn)C9orf72六核苷酸重復(fù)擴增（HRE）的雙肽重復(fù)序列（DPR）對無義介導的mRNA降解通路（NMD）有抑制作用。NMD是細胞中清除有害、錯誤RNA產(chǎn)物的一種監(jiān)測及防御機制，NMD的抑制可能是由于表達富含精氨酸的DPR的細胞中P-body（processing bodies）的減少所致。研究人員在細胞和果蠅模型中證明，通過遺傳和藥理方法重新激活NMD通路可以阻礙C9orf72富含精氨酸的DPR誘導的神經(jīng)毒性，最后確定了曲尼司特（tranilast）為NMD激活藥物。

研究思路

研究結(jié)果

1. C9orf72患者中NMD的抑制

為了評估C9orf72 HRE 患者的NMD途徑是否受到干擾，將不同C9orf72 ALS相關(guān)來源的已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與來自具有NMD缺陷的人細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行無偏生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)在C9orf72 ALS小腦組織和NMD缺陷的人細胞之間存在大量重疊的基因。通過GO分析發(fā)現(xiàn)，在這些重疊的基因中，應(yīng)激反應(yīng)和免疫系統(tǒng)相關(guān)基因顯著富集，同時對各個比較組的重疊基因進行深入分析，發(fā)現(xiàn)NMD調(diào)控的mRNA積累是一種與C9orf72產(chǎn)物特異相關(guān)的效應(yīng)。

圖1 C9orf72 ALS與具有NMD缺陷的細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2. 富含精氨酸的C9orf72雙肽重復(fù)序列抑制NMD

研究人員利用果蠅模型，通過RNA-seq分析來評估C9orf72 HRE產(chǎn)物在體內(nèi)是否會影響NMD的正常表達。作者研究了HRE和含有36個重復(fù)序列的脯氨酸-精氨酸雙肽（PR36）對果蠅NMD基因表達的影響。將表達HRE36或PR36的5日齡果蠅的腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與由UPF1缺失引起NMD通路缺陷的果蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了比較分析發(fā)現(xiàn)，這兩組中由于NMD被抑制而導致底物基因積累，其中36%的基因相同。結(jié)果表明，C9orf72富含精氨酸DPR的表達可能導致果蠅NMD的抑制。之后，研究人員在人神經(jīng)母細胞瘤細胞系（SH-SY5Y）和小鼠腦中進行了驗證。

圖2 C9orf72富含精氨酸DPR的表達導致果蠅NMD的抑制

3. C9orf72雙肽重復(fù)序列通過減少P-body豐度而抑制NMD

研究人員用免疫熒光標記技術(shù)對P-body和應(yīng)激顆粒進行研究，發(fā)現(xiàn)在表達富含精氨酸的DPR細胞中應(yīng)激顆粒的增加可能導致P-body的減少，即C9orf72富含精氨酸的DPR可通過減少P-body的豐度而抑制NMD。

圖3 GFP-GR36表達細胞P-body減少導致NMD抑制
注：GR36：甘氨酸精氨酸36個重復(fù)序列；GFP-GR36：毒性比未加標簽的GR36低，但毒性與PR36相當。

4. 激活NMD通路可以阻礙雙肽重復(fù)序列的毒性

UPF1是啟動NMD的關(guān)鍵蛋白，研究發(fā)現(xiàn)在人SH-SY5Y細胞中UPF1的表達可以有效地防止HRE36引起的細胞凋亡；在果蠅模型中UPF1能逆轉(zhuǎn)4種NMD底物的積累，并能有效地挽救PR36引起的運動神經(jīng)元和軸突投射的丟失。通過在人和果蠅實驗中的研究表明，通過增加NMD通路中核心蛋白的表達可恢復(fù)NMD的活性，從而阻礙富含精氨酸的DPR引起的神經(jīng)毒性。

圖4 UPF1完全阻斷GFP-GR36對SH-SY5Y細胞的毒性作用

此外，研究人員研究了四種化合物（tranilast, nifulumic acid, febuxostat and nitazoxanide），在人SH-SY5Y細胞中，研究發(fā)現(xiàn)曲尼司特可有效地重新激活NMD活性，有效地抑制GFP-GR36或HRE36誘導的細胞凋亡。在果蠅實驗中，經(jīng)曲尼司特處理后，果蠅蛹數(shù)顯著增加，成體存活率和運動功能顯著增強。因此，曲尼司特可解除C9orf72 DPR對人細胞和果蠅的神經(jīng)毒性。

結(jié)論

該項研究揭示了導致肌萎縮性側(cè)索硬化癥的新機制，證實了激活無義介導的mRNA降解通路可以作為治療ALS的新策略，發(fā)現(xiàn)了一種現(xiàn)用于治療哮喘的藥物有可能成為治療ALS的新藥。

文章科普

• 無義介導的mRNA降解通路（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）：一種廣泛存在于真核細胞中的mRNA質(zhì)量監(jiān)控機制，該機制能識別并降解含有提前終止密碼子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以防止毒性蛋白的產(chǎn)生。
• C9orf72基因突變：導致肌萎縮側(cè)索硬化癥的最主要的突變形式，該突變由GGGGCC長重復(fù)序列插入C9orf72基因的內(nèi)含子中造成。
• HRE（hexanucleotide repeat expansion）：六核苷酸重復(fù)擴增（GGGGCC）。
• DPR（dipeptide repeat）：雙肽重復(fù)序列。
• P-body（processing bodies）：NMD機制中的關(guān)鍵成分，它是一種無膜的核糖核蛋白顆粒，富含蛋白質(zhì)，參與RNA的降解。
• 曲尼司特（tranilast）：抗變態(tài)反應(yīng)藥，可用于支氣管哮喘及過敏性鼻炎的預(yù)防性治療。
• UPF1：NMD通路激活所必需的保守的基本調(diào)控蛋白，可促進核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶對mRNA的切割。
• 應(yīng)激顆粒（stress granules）：一種核糖核蛋白顆粒，在應(yīng)對細胞內(nèi)環(huán)境變化時起著重要的作用。
• PR36（proline-arginine dipeptide with 36 repeats）：脯氨酸-精氨酸雙肽36個重復(fù)序列。
• GR36（glycine-arginine dipeptide with 36 repeats）：甘氨酸-精氨酸雙肽36個重復(fù)序列。
• GFP-GR36：用GFP（綠色螢光蛋白）標記的GR36，它的毒性比未標記的GR36低，但毒性與PR36相當。

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參考文獻

Xu Wangchao, Bao Puhua, Jiang Xin, et al. Reactivation of nonsense-mediated mRNA decay protects against C9orf72 dipeptide-repeat neurotoxicity[J]. Brain, 2019, 142: 1349-1364.

來源：安諾基因