摘要：已有定論？CRISPR、RNAi、ASO哪種更適合lncRNA研究

如何開展lncRNA研究？

LncRNAs是一類長度在200nt以上，編碼蛋白能力有限的RNA分子。lncRNA基因的過表達、缺失或突變與包括癌癥在內的許多人類疾病有關；然而，大多數lncRNAs的功能仍然是未知的。因此，lncRNAs的功能研究已成為科研工作者關注的重點。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)為分子生物學的所有領域提供了一個革命性的基因組編輯工具。在lncRNA研究中，Cas9核酸酶可以刪除lncRNA基因，或者將RNA去穩(wěn)定元件引入其基因座。核酸酶缺陷型dCas9突變體保留了其RNA依賴性DNA結合活性，當與轉錄抑制因子或激活物結構域融合時可調節(jié)基因表達。來自德國癌癥研究中心（German Cancer Research Center）Goyal A等研究人員系統(tǒng)地分析了CRISPR方法是否適合靶向lncRNAs。

首先，研究人員對CRISPR方法用于lncRNAs研究提出了幾點疑問：

1、由于ncRNA功能的性質，CRISPRn誘變通常不適用于敲除非編碼基因組基因座。

• 首先，負責執(zhí)行轉錄本依賴性分子功能的lncRNA轉錄本序列通常是未確定的，這使得用Cas9對其進行誘變靶向幾乎是不可能的。
• 其次，對于通過自身轉錄行為發(fā)揮表型的lncRNA位點，這些功能可能不會受到Cas9誘變的影響，除非Cas9靶向控制lncRNA轉錄的調控區(qū)域，而這對于大多數lncRNA來說都是未知的。

2、CRISPRn切除可通過刪除其啟動子或整個lncRNA基因來產生lncRNA敲除，但需要考慮所有潛在的基因組調控元件的位置，這顯然是不太可能的。（lncRNA分類詳見文末小知識）

• 對于與其他基因交叉的lncRNA來說，選擇性切除全長lncRNA位點是不可能的，因為這將不可避免地改變這些基因的序列。
• 對于由內部/雙向啟動子產生的lncRNAs，通過刪除遠離其啟動子并且不與任何其他基因重疊的lncRNA部分，可能產生功能性敲除。然而，lncRNA的功能結構域可能位于重疊的外顯子中，而在這種情況下，lncRNA仍具有功能。
• 此外，刪除部分lncRNA而不去除其TSS可能導致新基因體的產生。在任何情況下，基因組切除都可能導致調節(jié)DNA元件的缺失，這可能會影響其他基因的轉錄，并導致原本不屬于lncRNA的表型。

3、通過同源定向敲入lncRNA基因TSS下游的轉錄終止信號或RNA去穩(wěn)定化元件，CRISPRn HR可用Cas9敲低lncRNA。然而，CRISPRn HR策略不能用于由內部啟動子產生的lncRNA，也不能用于其啟動子近端區(qū)域跨越其他基因而又不干擾其序列的lncRNA。

4、CRISPRa和CRISPRi涉及將dCas9募集到靶基因的啟動子近端區(qū)域，很可能影響鄰近基因的表達。因此，該技術不適合用于調節(jié)由雙向啟動子或位于其他基因起始位點附近的啟動子引起的lncRNA。并且將dCas9靶向內部啟動子也可能干擾宿主基因的轉錄。

因此，研究人員將上述所有的位點結構進行歸納，根據對鄰近基因的潛在影響，提出以下標準規(guī)則：

1. CRISPR方法不適合用于雙向啟動子轉錄的lncRNAs（正義、反義和基因間）；
2. CRISPR方法不適合用于近端啟動子轉錄的lncRNAs（正義、反義和基因間），當lncRNA的起始點位于鄰近基因起始位置接近2000bp時，稱之為“近端啟動子”；
3. CRISPR方法不適合用于內部啟動子轉錄的lncRNAs（正義和反義）。

隨后，全基因組分析顯示大多數lncRNAs不能被CRISPR/Cas9靶向

許多l(xiāng)ncRNAs來源于雙向啟動子或者與正義/反義基因的啟動子/基因體重疊。根據定義的lncRNA和啟動子類型對所有由Gencode注釋的lncRNAs進行分類。發(fā)現基因內lncRNAs占所有l(wèi)ncRNAs的64％，其中40％為反義lncRNAs，而由于多個相鄰基因的影響，正義lncRNAs只占13%，正反義類別占11％；基因間lncRNAs占剩余的36％。從獨立的啟動子和內部啟動子轉錄而來的lncRNAs各占40%，雙向轉錄的lncRNAs占20%。

在全基因組分析中，發(fā)現在15929個lncRNA基因位點中，只有38％的位點能夠穩(wěn)定（安全）地應用CRISPR，而多達62%的lncRNA基因位點存在引起鄰近基因功能失調的風險，這主要是由于它們內部（35％）或雙向（20％）啟動子所引起的。

接著，研究人員通過各種CRISPR方法對由雙向啟動子轉錄的lncRNAs NOP14-AS1、LOC389641、MNX1-AS1或HOTAIR進行敲低實驗，發(fā)現這些lncRNAs的表達顯著被抑制，但同時也會影響它們各自鄰近基因的表達。而基于ASO或siRNA的方法卻可在不影響lncRNAs鄰近基因表達的情況下敲低該lncRNAs的表達。

因此，盡管CRISPR/Cas9在雙向和順式調控表達方面具有優(yōu)勢，但基于ASO或siRNA的方法可能是特異性靶向復雜基因位點轉錄本更好的選擇。

RNAi在lncRNA功能缺失性研究中已經得到了廣泛而有效的應用。然而，與蛋白質編碼基因不同的是，許多l(xiāng)ncRNAs位于核內，盡管已經發(fā)現RNAi機制在細胞核中具有活性，但針對核內lncRNAs的siRNAs往往被證明效果較差。

另一種選擇是反義寡核苷酸(ASOs)，其涉及RNase-H介導的靶RNA裂解。ASOs可以更高效地靶向核lncRNAs，也可以消耗新生的轉錄本。

針對以上問題，銳博生物獨家推出Ribo^TM lncRNA Smart Silencer系列l(wèi)ncRNA抑制劑。對于細胞質定位、細胞核定位、細胞質和細胞核共定位以及定位不確定的lncRNA/基因，均可使用Smart Silencer進行干擾實驗，在正常細胞轉染效率條件下，可實現lncRNA/基因核內和胞質的全方位抑制。

Smart Silencer是由3條siRNA和3條ASO混合組成的即用型特異性lncRNA/基因抑制劑，可通過多種抑制機制獲得更高的沉默效果。相比普通siRNA具有更高靈敏度和抑制效率，是進行l(wèi)ncRNA/基因功能缺失性研究的理想選擇。

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因此，對于lncRNA功能缺失性研究更多客戶傾向于選擇Smart Silencer，相關研究成果更是發(fā)表在Science（IF41.058）、Science translational medicine（IF16.71）、Immunity（IF19.734）等國際頂級期刊。

1. Smart Silencer顯著抑制細胞質靶標

Wang P, et al. Science, 2017, 358(6366): 1051-1055.

FISH實驗證實lncRNA-ACOD1定位于細胞質，針對lncRNA-ACOD1 LOC105370268位點設計合成Smart Silencer，并轉染A549細胞，結果發(fā)現lncRNA-ACOD1 RNA的表達被顯著抑制。

2. Smart Silencer顯著抑制核內外靶標

Meng Q, et al. Science translational medicine, 2018, 10(472): eaat6912.

核質分離顯示：與細胞核lncRNA NEAT1和細胞質lncRNA OIP5-AS1相比，DGCR5是細胞核和細胞質共定位。將DGCR5 Silencer轉染hNPCs細胞可顯著敲低細胞核和細胞質中的DGCR5表達。

Liu J, et al. Immunity, 2019, 50(3): 600-615. e15.

核質分離與FISH實驗發(fā)現lnc-Dpf3主要位于細胞質，小部分位于細胞核。將lnc-Dpf3 Silencer轉染mDCs細胞可顯著敲低細胞核和細胞質中的lnc-Dpf3表達，從而增加CCR7介導的mDC遷移。

3. Smart Silencer顯著抑制細胞核靶標

Liu Y, et al. Cancer science, 2018, 109(7): 2188-2198.

RNA FISH實驗發(fā)現NEAT1定位于細胞核，將NEAT1 silencer轉染SKOV3和HO8910細胞抑制NEAT1的表達，可顯著抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力。

4. Smart Silencer顯著抑制定位不確定靶標

Li H, et al. Cardiovascular research, 2018, 114(5): 747-758.

對于定位不確定的lncRNAs，將RP11-544D21.2和XLOC_014288 siRNA (smart silencer)轉染HCMs細胞可分別顯著敲低RP11-544D21.2和XLOC_014288的表達水平，并且RP11-544D21.2敲低減少了HUVEC的管形成和遷移。

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Smart Silencer-lncRNA/基因

Smart Silencer對照

小知識：LncRNAs分類知多少

lncRNA基因座廣泛分布于整個基因組中，根據其基因組位置可分為基因間lncRNA（lincRNAs）和基因內lncRNAs。

1、基因間lncRNAs位于其他基因之間，可以由獨立或雙向啟動子轉錄而來。如果在頭對頭（5′-to-5’）方向上相鄰兩個基因TSSs之間的距離≤2kb，則將基因間lncRNAs的啟動子定義為雙向啟動子。

2、基因內lncRNAs分為正義和反義lncRNAs，這取決于lncRNAs相對于其交叉基因的轉錄方向。正義和反義lncRNAs又包含以下類別：

• Internal：當lncRNA嵌入另一個基因的基因體內并與其外顯子重疊時；
• Intronic：當lncRNA完全位于另一個基因的內含子內時；
• Overlapping：當另一個基因完全位于lncRNA的內含子內時。

此外，如果lncRNAs與基因起始位點之間的距離≤2kb，則與其他基因在頭對頭方向交叉的反義lncRNAs啟動子也被認為是雙向的。

來源：銳博生物