肖百龍博士課題組綜合利用生化結(jié)構(gòu)、電生理膜片鉗、高通量藥物篩選、轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及人類遺傳學(xué)等多學(xué)科研究手段，聚焦解答機(jī)械門控Piezo通道如何將機(jī)械力刺激轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)，以及其如何利用自身機(jī)械敏感性和通道特性來決定相關(guān)的生理病理功能這兩方面的關(guān)鍵科學(xué)問題，并致力于開發(fā)以Piezo通道為靶點(diǎn)的新型藥物及技術(shù)。迄今以通訊作者（含共同）身份在Piezo通道的三維結(jié)構(gòu)解析(Nature 2015, 2018，2019)、分子機(jī)制揭示 (Neuron 2016；Nature Communications 2017)、小分子藥物發(fā)現(xiàn)(Nature Communications 2018)、以及生理病理功能探索(Cell Reports 2019；eLife 2019)等方面取得了系列重要研究成果。

在最新的這篇《自然》論文中，依托兩個(gè)課題組之前對(duì)Piezo1通道進(jìn)行冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析所建立的技術(shù)體系和研究平臺(tái)，研究人員經(jīng)過 6年多的不懈努力，克服全長2822個(gè)氨基酸的鼠源Piezo2表達(dá)量極低的困難，通過對(duì)蛋白純化條件以及冷凍電鏡制樣方法的不斷摸索和優(yōu)化，最終獲得了性質(zhì)穩(wěn)定均一的蛋白樣品用于冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集。在結(jié)構(gòu)解析過程中，由于Piezo蛋白具有極高的柔性，為解析高分辨率結(jié)構(gòu)帶來極大的挑戰(zhàn)。研究人員將Piezo2數(shù)據(jù)顆粒進(jìn)行對(duì)稱性擴(kuò)展，并切割成三個(gè)部分獨(dú)立計(jì)算，得到高分辨的各部分結(jié)構(gòu)后再拼合成完整結(jié)構(gòu)，克服了柔性問題，最終獲得了整體分辨率為3.6-3.8?的三維結(jié)構(gòu)(圖a)，并成功解析了Piezo2蛋白包含38次跨膜螺旋區(qū)的完整拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖c, d)。

研究者們發(fā)現(xiàn)，Piezo2通道的整體三維結(jié)構(gòu)和之前所解析的Piezo1通道類似，以同源三聚體形式組裝成包含114次跨膜螺旋區(qū)的三葉螺旋槳狀結(jié)構(gòu)(圖a-d)，確立了Piezo通道是迄今已知的含跨膜次數(shù)最多的一類大型膜蛋白。其中第1到第36次跨膜螺旋區(qū)（TM1-36）依次以4次跨膜螺旋區(qū)為單元組裝成共9個(gè)重復(fù)性的結(jié)構(gòu)單元，這一特征性結(jié)構(gòu)單元之前以清華大學(xué)英文縮寫命名為THU (Transmembrane Helical Unit，跨膜螺旋單元) (圖c, d)。非常有意思的是這9個(gè)THU串聯(lián)組成一個(gè)特殊的非平面的跨膜“槳葉”(Blade)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致三個(gè)槳葉圍合成一個(gè)直徑28 nm而深度10 nm的往細(xì)胞內(nèi)測凹陷的穹頂狀結(jié)構(gòu)(圖b)。研究者推測這一穹頂狀Piezo蛋白－細(xì)胞膜系統(tǒng)可能是Piezo通道具有高度機(jī)械敏感性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一。

位于中心孔道區(qū)域上方的胞外“帽子”(Cap)結(jié)構(gòu)域完全嵌在穹頂?shù)撞?(圖a, b)，而細(xì)胞內(nèi)側(cè)則有一根9 nm長的長桿區(qū)結(jié)構(gòu)(Beam)將槳葉的外周端連接到中心孔道的胞內(nèi)部位 (圖a-e)。第38次跨膜螺旋（取名為inner helix，IH）和尾隨的胞內(nèi)羧基端結(jié)構(gòu)域(CTD)圍繞形成中心孔道部分(圖e, f)，包含位于跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的狹窄頸部(圖f, g)，提示該P(yáng)iezo通道結(jié)構(gòu)處于關(guān)閉態(tài)。Piezo2與Piezo1的結(jié)構(gòu)比較表明，跨膜區(qū)狹窄位點(diǎn)在Piezo2結(jié)構(gòu)中處于完全關(guān)閉狀態(tài)，而在Piezo1中則處于開放狀態(tài)(圖f, g)。據(jù)此，研究者提出該狹窄位點(diǎn)形成跨膜區(qū)的開關(guān)閘門(TM gate) (圖f, g)。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析和電生理功能實(shí)驗(yàn)表明該閘門可能通過頂端帽子結(jié)構(gòu)域的旋轉(zhuǎn)來控制(圖h)。而由于位于胞質(zhì)區(qū)的狹窄頸部(cytosolic constriction neck)在Piezo1和Piezo2結(jié)構(gòu)中都處于關(guān)閉狀態(tài)(圖f, g)，因此該位點(diǎn)是否作為另一個(gè)開關(guān)閘門而被槳葉和長桿結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化所控制還有待進(jìn)一步證明。

肖百龍博士表示，通過與李雪明博士課題組的通力合作，從Piezo1到Piezo2結(jié)構(gòu)的解析不僅有力推動(dòng)了對(duì)哺乳動(dòng)物機(jī)械門控Piezo通道的結(jié)構(gòu)和機(jī)械門控機(jī)制的理解，也為探究Piezo通道的功能失常所引發(fā)的人類疾病機(jī)理及其相關(guān)藥物的鑒定發(fā)現(xiàn)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。依托其課題組已經(jīng)建立的Piezo通道的全方位研究平臺(tái)和學(xué)術(shù)積累，他們將致力于Piezo通道的藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)工作。

清華大學(xué)藥學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心PI肖百龍博士和生命科學(xué)學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心PI李雪明博士為本論文共同通訊作者。清華大學(xué)藥學(xué)院博士后王莉、生命學(xué)院2015級(jí)博士生周珩、2013級(jí)博士生張明敏及2016級(jí)博士生劉文豪為并列第一作者。此外，肖百龍課題組的博士生鄧團(tuán)、趙前程（現(xiàn)耶魯大學(xué)博士后）、李祎然也參與了部分研究工作。清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)的雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。

本研究得到了科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFA0500402，2016YFA0501102，2016YFA0501902）、國家自然科學(xué)基金委杰出青年科學(xué)基金以及重點(diǎn)項(xiàng)目（31825014, 31630090，31570730）、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心以及生物膜國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的資助，同時(shí)得到了清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)、清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)以及國家蛋白質(zhì)設(shè)施實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心(北京)的支持。