代表通用dCas9系統(tǒng)（頂部）和Cascade系統(tǒng)（底部）的組件的插圖：Gersbach Lab

2類CRISPR–Cas系統(tǒng)，例如Cas9和Cas12，已被廣泛用于靶向真核基因組中的DNA序列。但是，代表自然界中所有CRISPR系統(tǒng)90％的1類CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因組工程應(yīng)用中仍未開發(fā)。杜克大學(xué)(Duke University)的生物醫(yī)學(xué)工程師利用此前未被探索的CRISPR技術(shù)，精確地調(diào)控和編輯人類細(xì)胞中的基因組。通過這種新方法，研究人員希望能極大地?cái)U(kuò)展基于CRISPR的生物醫(yī)學(xué)工程師可用工具，為基因組工程技術(shù)開辟一個(gè)新的、多樣化的前沿。

該項(xiàng)研究發(fā)表在9月23日的《Nature Biotechnology》雜志上。杜克大學(xué)魯尼家族生物醫(yī)學(xué)工程副教授Charles Gersbach和格斯巴赫實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員Adrian Oliver是該項(xiàng)研究的領(lǐng)導(dǎo)者。

https://doi.org/10.1038/s41587-019-0235-7

CRISPR-Cas是一種防御系統(tǒng)，其中細(xì)菌利用RNA分子和CRISPR相關(guān)（Cas）蛋白靶向并破壞入侵病毒的DNA。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和分子機(jī)制的重新定位引發(fā)了一場(chǎng)基因組編輯革命，因?yàn)檠芯咳藛T學(xué)會(huì)了如何利用這一工具專門針對(duì)和編輯人類細(xì)胞中的DNA。。

CRISPR-Cas9是當(dāng)今最常用的基因組編輯工具，并被歸類為2類CRISPR系統(tǒng)。2類系統(tǒng)在細(xì)菌世界中不太常見，但從理論上講它們更易于操作，因?yàn)樗鼈儍H依賴一種Cas蛋白來靶向和切割DNA。

而1類系統(tǒng)也沒那么簡(jiǎn)單，它依靠多種蛋白質(zhì)在一個(gè)稱為Cascade（抗病毒防御的CRISPR關(guān)聯(lián)復(fù)合物）的復(fù)合物中共同作用來靶向DNA。結(jié)合后，Cascade聚集可切割DNA的Cas3蛋白。

Gersbach教授說：“從世界上所有細(xì)菌的單個(gè)CRISPR系統(tǒng)觀察來看，將近90％是1類系統(tǒng)。CRISPR-Cas是生物技術(shù)工具一個(gè)不可思議的來源，然而直到現(xiàn)在，人們還是只關(guān)注到其中的一小部分。”

為了證明1類系統(tǒng)的功能，Oliver博士將基因激活劑連接到了I型大腸桿菌級(jí)聯(lián)復(fù)合體的特定位點(diǎn)，并將該系統(tǒng)靶向結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的基因啟動(dòng)子。因?yàn)樗膶?shí)驗(yàn)中沒有添加Cas3蛋白，所以沒有切割DNA，也沒有改變基礎(chǔ)的DNA序列。實(shí)驗(yàn)表明，Cascade激活劑不僅可以結(jié)合到正確的位點(diǎn)上，提高靶基因的水平，而且其準(zhǔn)確性和特異性可與CRISPR / Cas9相媲美。

Oliver使用來自另一種細(xì)菌菌株的I類級(jí)聯(lián)復(fù)合物重復(fù)了該過程，該菌株在各靶點(diǎn)作用強(qiáng)大。另外她還表明，可以將激活域替換為阻遏物，從而關(guān)閉靶基因。研究人員再次指出，該方法的準(zhǔn)確性和特異性可與CRISPR / Cas9方法媲美。

Oliver說：“我們發(fā)現(xiàn)Cascade的結(jié)構(gòu)非常模塊化，可以在多個(gè)位置連接激活物或阻遏物，這是改變?nèi)祟惣?xì)胞基因表達(dá)的重要工具。Cascade的靈活性將使它成為有前途的基因組工程技術(shù)?！?/p>

北卡羅來納州立大學(xué)(North Carolina State University)益生菌研究領(lǐng)域的著名教授Barrangou對(duì)此項(xiàng)研究給予高度評(píng)價(jià)：這項(xiàng)工作及其所產(chǎn)生的技術(shù)是北卡羅萊納州研究三角的跨學(xué)科和跨大學(xué)的協(xié)作高度創(chuàng)新性和生產(chǎn)力的絕佳示例。

目前，該團(tuán)隊(duì)對(duì)他們的研究以及該領(lǐng)域其他研究人員的研究感到樂觀，此舉也將激發(fā)科研人員對(duì)1類CRISPR系統(tǒng)的新研究。Gersbach說：“該項(xiàng)目的目的是探索CRISPR系統(tǒng)的多樣性。在過去的十年中，已經(jīng)有成千上萬(wàn)篇關(guān)于CRISPR-Cas9的論文，但是我們一直在不斷學(xué)習(xí)有關(guān)它的新知識(shí)。通過這項(xiàng)研究，我們將這種思維方式應(yīng)用到了其中的另外90％。”

到目前為止，該團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明，這些1類系統(tǒng)在準(zhǔn)確性和應(yīng)用方面可與CRISPR-Cas9媲美。對(duì)于未來的研究方向，他們將進(jìn)一步探索這些系統(tǒng)與2類同類系統(tǒng)之間的差異，以及這些差異如何對(duì)生物技術(shù)有效應(yīng)用。

該團(tuán)隊(duì)還對(duì)研究1類系統(tǒng)如何應(yīng)對(duì)CRISPR-Cas研究的一般挑戰(zhàn)感興趣，特別是那些使?jié)撛谥委煈?yīng)用復(fù)雜化的問題，例如對(duì)Cas蛋白的免疫反應(yīng)以及同時(shí)使用多種類型的CRISPR實(shí)現(xiàn)不同基因組工程功能的問題。Gersbach說：“我們知道CRISPR可能對(duì)人類健康產(chǎn)生重大影響。但是我們?nèi)蕴幱诹私馊绾问褂肅RISPR，它可以做什么以及我們可以使用哪些系統(tǒng)的開始階段。我們希望這個(gè)新工具將為基因組工程的新領(lǐng)域提供支持。”

來源：生物探索

參考資料：

[1] New CRISPR class expands genetic engineering toolbox

[2] Targeted transcriptional modulation with type I CRISPR–Cas systems in human cells