非酒精性脂肪肝疾?。∟AFLD）已成為全球關(guān)注的主要公共健康問題。該疾病目前影響了西方國家總?cè)丝诘?0-35％，并且10％的患者可以從良性脂肪變性發(fā)展為更嚴(yán)重的疾病，包括脂肪性肝炎、肝硬化和肝衰竭。此外，多項證據(jù)表明NAFLD與亞臨床動脈粥樣硬化的多種標(biāo)志物之間有很強的相關(guān)性，而與傳統(tǒng)危險因素?zé)o關(guān)。因此，NAFLD的不良反應(yīng)不僅局限于肝損傷的惡化，而且還為動脈粥樣硬化和其他相關(guān)心血管疾?。–VD）的發(fā)生提供了獨立風(fēng)險。動脈粥樣硬化被認為是由脂質(zhì)異常積累和炎性細胞在血管內(nèi)皮浸潤引起的一種慢性炎性代謝疾病。動脈粥樣硬化形成的第一步是內(nèi)皮損傷和功能障礙。臨床和實驗數(shù)據(jù)均表明NAFLD、內(nèi)皮功能障礙與CVD之間存在密切關(guān)聯(lián)，但其潛在機制尚不清楚。
NAFLD和CVD之間的聯(lián)系揭示了細胞間通訊在疾病致病過程中的重要性。眾所周知，細胞不僅可通過直接接觸和可溶性因子進行通信，而且還可通過膜衍生的納米大小的囊泡，即細胞外囊泡（EVs）進行通信。EVs攜帶大量供體細胞衍生的分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。通過將這些生物活性成分轉(zhuǎn)移到靶細胞中，EVs在細胞間通訊中起著至關(guān)重要的作用。EVs在包括肝臟疾病在內(nèi)的生理或病理條件下釋放，并對靶細胞產(chǎn)生廣泛的影響。在各種分子中，miRNAs被認為是EVs功能的重要組成部分。miRNAs作為EVs的重要載體，已成為各種疾病（包括NAFLD和CVD）發(fā)病機制的關(guān)鍵調(diào)控因子。
為了探討NAFLD狀態(tài)下肝細胞來源的細胞外囊泡（EVs）在內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化形成中的潛在作用。最近，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院夏樸教授課題組在Journal of Hepatology（IF18.946）期刊上發(fā)表了題為Hepatocyte-Derived Extracellular Vesicles Promote Endothelial Inflammation and Atherogenesis via microRNA-1的研究論文。發(fā)現(xiàn)肝細胞來源的EVs通過microRNA-1下調(diào)KLF4并激活NF-κB通路來促進內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生。揭示了肝臟與血管之間遠距離通訊的新機制，并提出了預(yù)防和治療CVD，尤其是NAFLD患者的新方法。下面小編就帶大家一起來學(xué)習(xí)一下這篇文章吧~~~為了鑒定在脂肪變性條件下從肝細胞釋放的EVs，研究人員采用了一種常見的肝脂肪變性細胞模型，其中肝細胞長期暴露于飽和游離脂肪酸棕櫚酸（PA）。然后通過超速離心從細胞培養(yǎng)基中收集了EVs，并通過納米粒徑追蹤分析（NTA）和透射電鏡對它們進行表征。發(fā)現(xiàn)EVs的粒徑分布為30-200nm，PA處理可使Huh7肝細胞釋放的EVs增加近10倍，并且還略微增加了EVs的平均尺寸。此外，EVs富含外泌體的特征性標(biāo)志物，包括Tsg101、CD63和CD81，而沒有表達與其他細胞器相關(guān)的蛋白質(zhì)。表明收集到的大多數(shù)EVs可能是源自肝細胞的外泌體。脂肪變性肝細胞來源的EVs的功能研究：誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞炎癥損傷為了研究EVs在肝細胞與血管內(nèi)皮細胞相互作用中的作用，研究人員首先檢測了內(nèi)皮細胞是否可以攝取肝細胞來源的EVs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞可有效吸收肝細胞來源的EVs，并且脂肪變性肝細胞來源的EVs也更傾向于遞送到內(nèi)皮細胞。然后研究人員評估了EVs對受體內(nèi)皮細胞的影響。發(fā)現(xiàn)PA處理的EVs（PAEV）上調(diào)的前10個基因主要與內(nèi)皮炎癥有關(guān)，包括E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、IL-1β和MMP-1。此外，p65磷酸化和IκB降解也顯著增加，暗示NF-κB通路被激活。之后，研究人員通過NF-κB特異性報告基因?qū)嶒烌炞C了肝細胞來源的EVs對NF-κB活化的影響。研究發(fā)現(xiàn)PAEV處理可顯著增加報告基因活性，進一步證明了NF-κB通路是由脂肪肝細胞來源的EVs所激活。為了進一步闡明脂肪變性肝細胞來源的EVs對內(nèi)皮細胞的影響，研究人員從HFD誘導(dǎo)的肥胖（DIO）小鼠中分離了原代肝細胞，然后與小鼠主動脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)與脂肪肝衍生的肝細胞共培養(yǎng)導(dǎo)致E-selectin、ICAM-1和VCAM-1表達以及NF-κB活化顯著增加。而用中性鞘磷脂酶抑制劑GW4869（可有效阻斷EV釋放）對肝細胞進行預(yù)處理，幾乎完全消除了與脂肪肝衍生的肝細胞共培養(yǎng)對內(nèi)皮細胞的影響。表明脂肪變性肝細胞通過釋放EVs可有效地促進內(nèi)皮炎癥。EV miRNA表達譜分析：確定EVs促炎作用的相關(guān)因子miR-1為了確定EVs促炎作用的相關(guān)因子，研究人員通過miRNA測序（EVs miRNA測序服務(wù)由銳博生物提供）對DIO和正常對照小鼠原代肝細胞來源的EVs（DIOEV和NCEV）進行miRNA表達譜分析。發(fā)現(xiàn)在差異表達的miRNAs中，miR-1簇（包括miR-1a-3p和miR-1b-5p）在DIOEV中上調(diào)最顯著。在DIO小鼠總肝臟組織和原代肝細胞中也觀察到miR-1表達升高，但是miR-1在DIOEV中的上調(diào)程度要高于肝組織和肝細胞，表明miR-1在脂肪變性肝細胞來源的EVs中選擇性富集。此外，人類miR-1（miR-1-3p、miR-206和miR-1-5p）在經(jīng)PA處理的人類Huh7肝細胞衍生的EVs中也顯著升高。表明脂肪變性肝細胞改變了EVs中的miRNA表達譜，顯著上調(diào)了miRNA-1的表達。miR-1體外功能研究：促進內(nèi)皮細胞炎癥考慮到脂肪變性肝細胞來源的EVs的促炎作用和EVs中miR-1的顯著上調(diào)，研究人員猜想miR-1是否也可模擬EV誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TNFα刺激下，過表達miR-1或miR-206可導(dǎo)致E-selectin、ICAM-1和VCAM-1的mRNA和蛋白水平顯著增加，同時TNFα誘導(dǎo)的NF-κB活化和單核細胞在內(nèi)皮細胞上的粘附也顯著增加，說明miR-1具有很強的促炎作用。接著，研究人員通過生物信息學(xué)分析在KLF4的3’UTR中發(fā)現(xiàn)了一個miR-1結(jié)合位點。過表達miR-1或miR-206可顯著下調(diào)KLF4的表達。而過表達KLF4可極大地消除miR-1誘導(dǎo)的VCAM-1表達，下調(diào)KLF4的表達則能夠模擬并增強miR-1的作用。此外，將miR-1 mimics與KLF4 3’-UTR報告基因共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶活性，證實了miR-1對KLF4的直接作用。肝細胞來源的EVs促進內(nèi)皮細胞炎癥的機制研究在證實了miR-1的促炎作用后，研究人員推測EV來源的miR-1在脂肪變性條件下介導(dǎo)了肝細胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)。因此，研究人員首先將Cy3標(biāo)記的miR-1 mimic轉(zhuǎn)染到Huh7細胞并與HUVECs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)熒光染料在HUVECs中明顯積累。此外，miR-1定量分析顯示內(nèi)皮細胞中幾乎未檢測到內(nèi)源性miR-1表達，但在共培養(yǎng)后其表達顯著升高。而通過GW4869阻斷肝細胞EV的釋放可消除HUVECs中miR-1的增加，表明肝細胞通過釋放EVs將miR-1遞送到內(nèi)皮細胞。接著，研究人員將HUVECs暴露于PAEV出現(xiàn)了類似的miR-1表達水平的升高。而用anti-miR-1 inhibitor處理HUVEC可顯著減弱PAEV誘導(dǎo)的NF-κB活化，并且抑制miR-1可逆轉(zhuǎn)PAEV誘導(dǎo)的KLF4抑制。綜上所述，miR-1在介導(dǎo)脂肪變性肝細胞來源的EVs對內(nèi)皮細胞的促炎作用中起重要作用。由于內(nèi)皮炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，因此研究人員探索了miR-1在體內(nèi)的促炎癥作用。首先，通過喂養(yǎng)HFD構(gòu)建ApoE?/?小鼠動脈粥樣硬化動物模型，并用antagomiR-1（由銳博生物提供）治療小鼠以阻斷miR-1的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠主動脈組織中的炎癥表型被顯著減弱，證實了antagomiR-1對實驗動物的療效。此外，antagomiR-1治療可顯著減少主動脈弓、胸主動脈區(qū)和整個主動脈中動脈粥樣硬化斑塊的數(shù)量和大小，并且可使小鼠的病變區(qū)域明顯減少。另外antagomiR-1可顯著降低平滑肌肌動蛋白（SMA）水平和ICAM-1的表達，表明antagomiR-1能夠抑制斑塊內(nèi)血管平滑肌細胞的生長，減輕動脈粥樣硬化病變。這些結(jié)果表明抑制miR-1可以顯著改善ApoE?/?小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。原文：Jiang F, Chen Q, Wang W, et al. Hepatocyte-Derived Extracellular Vesicles Promote Endothelial Inflammation and Atherogenesis via microRNA-1[J]. Journal of Hepatology, 2019.
本文系作者 @銳博生物 授權(quán)發(fā)布在 肽度TIMEDOO。未經(jīng)許可，禁止轉(zhuǎn)載。
