12 月 18 日《自然》(Nature)雜志在線發(fā)表了一篇題為 Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR-Cas system 的新研究，來(lái)自哥倫比亞大學(xué)的科學(xué)家們利用冷凍電子顯微鏡捕獲了一種新的基因編輯工具的首批圖像。

該團(tuán)隊(duì)在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的“跳躍基因”，其可以在不引入 DNA 斷裂的情況下往基因組中插入大量的遺傳有效載荷，研究人員以此開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的基因編輯工具，稱為INTEGRATE（Insertion of transposable elements by guide RNA-assisted targeting）。

（來(lái)源：Nature）

這種全新的工具有望改進(jìn)現(xiàn)有的 CRISPR 工具，通過(guò)冷凍電子顯微鏡將這種復(fù)雜的基因編輯過(guò)程凍結(jié)起來(lái)，揭示了基因編輯過(guò)程的高分辨率細(xì)節(jié)。

“我們?cè)谘芯恐姓故玖巳绾卫?INTEGRATE 技術(shù)在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行靶向 DNA 插入?！备鐐惐葋喆髮W(xué)瓦格洛斯學(xué)院生物化學(xué)和分子生物物理學(xué)助理教授 Sam Sternberg 博士與 Israel Fernandez 博士共同領(lǐng)導(dǎo)了這項(xiàng)研究，Sam Sternberg 說(shuō)道，“與 Israel Fernandez 實(shí)驗(yàn)室這一次奇妙合作出的這些新圖像，以令人難以置信的分子細(xì)節(jié)解釋了這一生物過(guò)程，并將幫助我們通過(guò)蛋白質(zhì)工程努力來(lái)改進(jìn)該系統(tǒng)?！?/p>

新的基因編輯工具

現(xiàn)在，世界各地的許多研究人員都使用 CRISPR-Cas9 來(lái)快速、廉價(jià)地精確修改細(xì)胞的基因組。然而，CRISPR 的大多數(shù)應(yīng)用都涉及要切斷目標(biāo) DNA 的兩條鏈，然后利用宿主細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制將 DNA 斷裂修復(fù)。

控制這一修復(fù)過(guò)程仍然是該領(lǐng)域的一個(gè)主要挑戰(zhàn)，因?yàn)樵谶@個(gè)過(guò)程中常常不經(jīng)意地引入不希望發(fā)生的基因編輯。此外，現(xiàn)有的基因編輯工具仍然難以實(shí)現(xiàn)以精確的方式插入大型遺傳有效載荷。提高基因編輯的準(zhǔn)確性是研究人員的首要任務(wù)，也是確保用這種技術(shù)開(kāi)發(fā)疾病治療方法的安全性的關(guān)鍵。

由 Sternberg 實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的 INTEGRATE 系統(tǒng)，可以精確插入大的 DNA 序列，而且不需要依靠細(xì)胞機(jī)制來(lái)修復(fù) DNA 鏈。因此，與目前廣泛使用的傳統(tǒng) CRISPR-Cas 系統(tǒng)相比，INTEGRATE 可能被證明是一種更準(zhǔn)確、更有效的進(jìn)行某些基因修飾的方法。

圖 ｜ INTEGRATE 與 DNA 結(jié)合的冷凍電鏡圖像（來(lái)源：Sternberg and Fernández Labs）

這種新工具還可以幫助科學(xué)家在 DNA 修復(fù)活動(dòng)有限的細(xì)胞類型（如神經(jīng)元）中實(shí)現(xiàn)基因編輯，因?yàn)樵谶@類細(xì)胞中，使用 CRISPR 進(jìn)行基因編輯的嘗試相對(duì)不那么成功。

首次捕捉的細(xì)節(jié)

研究人員使用了一種獲得諾貝爾獎(jiǎng)的技術(shù)——冷凍電子顯微鏡，通過(guò)在液氮中快速冷凍一個(gè)基因編輯復(fù)合體樣本，用電子轟擊，然后他們利用電子顯微鏡捕捉到的圖像，生成一個(gè)集成系統(tǒng)的原子分辨率模型。

結(jié)構(gòu)模型表明，復(fù)合材料是由兩個(gè)主要部分組成的螺旋狀長(zhǎng)絲。更大的部分，稱為 Cascade，環(huán)繞并攜帶引導(dǎo) RNA，用于掃描細(xì)胞中匹配的 DNA 序列。一旦它定位并結(jié)合目標(biāo)序列，就會(huì)通過(guò)位于復(fù)合物末端的 TniQ“轉(zhuǎn)位”蛋白質(zhì)將 DNA 鏈串聯(lián)起來(lái)，并吸收其他有助于修飾 DNA 的酶。

INTEGRATE 的掃描機(jī)制與其他研究成熟的 CRISPR 系統(tǒng)的工作方式相似，其中一些還包含一個(gè)帶有導(dǎo)向 RNA 的 Cascade 復(fù)合體。然而，不像其他的 CRISPR 系統(tǒng)使用 Cascade 復(fù)合體來(lái)針對(duì) DNA 進(jìn)行切割，INTEGRATE 的 Cascade 功能是針對(duì) DNA 進(jìn)行高度精確的遺傳有效載荷插入。

圖 ｜ INTEGRATE 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，Cascade（深藍(lán)色）、TniQ（淺藍(lán)色）和向?qū)?RNA（紅色）（來(lái)源：Sternberg and Fernández Labs）

“如此規(guī)模的可視化生物學(xué)過(guò)程真的很神奇，甚至可以輕易地激發(fā)那些不熟悉這個(gè)領(lǐng)域的人。這項(xiàng)工作的質(zhì)量和完成的速度，得益于 Sam 和 Israel 這樣的厲害導(dǎo)師所提供的合作環(huán)境?！备鐐惐葋喆髮W(xué)歐文醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞分子和生物物理研究項(xiàng)目博士生、該研究第一作者 Tyler Halpin-Healy 說(shuō)。

在他們之前的研究中，Sternberg 和他的同事利用遺傳學(xué)和生物化學(xué)提出 CRISPR 機(jī)制如何在功能上與轉(zhuǎn)位機(jī)制（負(fù)責(zé)基因 “跳躍” 的分子）相聯(lián)系，這次研究證明了他們的假設(shè)是正確的。

除了指導(dǎo)未來(lái)的工程努力方向，這些結(jié)構(gòu)圖像還暗示了一個(gè)可能的校對(duì)檢查點(diǎn)?，F(xiàn)有的 CRISPR 技術(shù)經(jīng)常遭受所謂的 “脫靶效應(yīng)”，在這種情況下，序列被意外修改。新的結(jié)構(gòu)揭示了 Cascade 和 TniQ 如何協(xié)同工作，以確保只有正確的“目標(biāo)” 序列被標(biāo)記為 DNA 插入。研究人員計(jì)劃進(jìn)一步探索這種檢查點(diǎn)，同時(shí)開(kāi)發(fā)新的疾病治療工具。

哥倫比亞大學(xué)已經(jīng)提交了與這項(xiàng)工作相關(guān)的專利申請(qǐng)。據(jù)了解，Sam Sternberg 博士還是 Dahlia Biosciences 的聯(lián)合創(chuàng)始人和科學(xué)顧問(wèn)，也是 Dahlia Biosciences 和 Caribou Biosciences 的股東。

來(lái)源：MIT科技評(píng)論