12 月 18 日《自然》(Nature)雜志在線發(fā)表了一篇題為 Structural basis of DNA targeting by a transposon-encoded CRISPR-Cas system 的新研究，來自哥倫比亞大學(xué)的科學(xué)家們利用冷凍電子顯微鏡捕獲了一種新的基因編輯工具的首批圖像。

該團隊在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)了一種獨特的“跳躍基因”，其可以在不引入 DNA 斷裂的情況下往基因組中插入大量的遺傳有效載荷，研究人員以此開發(fā)了一個新的基因編輯工具，稱為INTEGRATE（Insertion of transposable elements by guide RNA-assisted targeting）。

（來源：Nature）

這種全新的工具有望改進現(xiàn)有的 CRISPR 工具，通過冷凍電子顯微鏡將這種復(fù)雜的基因編輯過程凍結(jié)起來，揭示了基因編輯過程的高分辨率細(xì)節(jié)。

“我們在研究中展示了如何利用 INTEGRATE 技術(shù)在細(xì)菌細(xì)胞中進行靶向 DNA 插入?！备鐐惐葋喆髮W(xué)瓦格洛斯學(xué)院生物化學(xué)和分子生物物理學(xué)助理教授 Sam Sternberg 博士與 Israel Fernandez 博士共同領(lǐng)導(dǎo)了這項研究，Sam Sternberg 說道，“與 Israel Fernandez 實驗室這一次奇妙合作出的這些新圖像，以令人難以置信的分子細(xì)節(jié)解釋了這一生物過程，并將幫助我們通過蛋白質(zhì)工程努力來改進該系統(tǒng)。”

新的基因編輯工具

現(xiàn)在，世界各地的許多研究人員都使用 CRISPR-Cas9 來快速、廉價地精確修改細(xì)胞的基因組。然而，CRISPR 的大多數(shù)應(yīng)用都涉及要切斷目標(biāo) DNA 的兩條鏈，然后利用宿主細(xì)胞自身的修復(fù)機制將 DNA 斷裂修復(fù)。

控制這一修復(fù)過程仍然是該領(lǐng)域的一個主要挑戰(zhàn)，因為在這個過程中常常不經(jīng)意地引入不希望發(fā)生的基因編輯。此外，現(xiàn)有的基因編輯工具仍然難以實現(xiàn)以精確的方式插入大型遺傳有效載荷。提高基因編輯的準(zhǔn)確性是研究人員的首要任務(wù)，也是確保用這種技術(shù)開發(fā)疾病治療方法的安全性的關(guān)鍵。

由 Sternberg 實驗室開發(fā)的 INTEGRATE 系統(tǒng)，可以精確插入大的 DNA 序列，而且不需要依靠細(xì)胞機制來修復(fù) DNA 鏈。因此，與目前廣泛使用的傳統(tǒng) CRISPR-Cas 系統(tǒng)相比，INTEGRATE 可能被證明是一種更準(zhǔn)確、更有效的進行某些基因修飾的方法。

圖 ｜ INTEGRATE 與 DNA 結(jié)合的冷凍電鏡圖像（來源：Sternberg and Fernández Labs）

這種新工具還可以幫助科學(xué)家在 DNA 修復(fù)活動有限的細(xì)胞類型（如神經(jīng)元）中實現(xiàn)基因編輯，因為在這類細(xì)胞中，使用 CRISPR 進行基因編輯的嘗試相對不那么成功。

首次捕捉的細(xì)節(jié)

研究人員使用了一種獲得諾貝爾獎的技術(shù)——冷凍電子顯微鏡，通過在液氮中快速冷凍一個基因編輯復(fù)合體樣本，用電子轟擊，然后他們利用電子顯微鏡捕捉到的圖像，生成一個集成系統(tǒng)的原子分辨率模型。

結(jié)構(gòu)模型表明，復(fù)合材料是由兩個主要部分組成的螺旋狀長絲。更大的部分，稱為 Cascade，環(huán)繞并攜帶引導(dǎo) RNA，用于掃描細(xì)胞中匹配的 DNA 序列。一旦它定位并結(jié)合目標(biāo)序列，就會通過位于復(fù)合物末端的 TniQ“轉(zhuǎn)位”蛋白質(zhì)將 DNA 鏈串聯(lián)起來，并吸收其他有助于修飾 DNA 的酶。

INTEGRATE 的掃描機制與其他研究成熟的 CRISPR 系統(tǒng)的工作方式相似，其中一些還包含一個帶有導(dǎo)向 RNA 的 Cascade 復(fù)合體。然而，不像其他的 CRISPR 系統(tǒng)使用 Cascade 復(fù)合體來針對 DNA 進行切割，INTEGRATE 的 Cascade 功能是針對 DNA 進行高度精確的遺傳有效載荷插入。

圖 ｜ INTEGRATE 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，Cascade（深藍色）、TniQ（淺藍色）和向?qū)?RNA（紅色）（來源：Sternberg and Fernández Labs）

“如此規(guī)模的可視化生物學(xué)過程真的很神奇，甚至可以輕易地激發(fā)那些不熟悉這個領(lǐng)域的人。這項工作的質(zhì)量和完成的速度，得益于 Sam 和 Israel 這樣的厲害導(dǎo)師所提供的合作環(huán)境?！备鐐惐葋喆髮W(xué)歐文醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞分子和生物物理研究項目博士生、該研究第一作者 Tyler Halpin-Healy 說。

在他們之前的研究中，Sternberg 和他的同事利用遺傳學(xué)和生物化學(xué)提出 CRISPR 機制如何在功能上與轉(zhuǎn)位機制（負(fù)責(zé)基因 “跳躍” 的分子）相聯(lián)系，這次研究證明了他們的假設(shè)是正確的。

除了指導(dǎo)未來的工程努力方向，這些結(jié)構(gòu)圖像還暗示了一個可能的校對檢查點?，F(xiàn)有的 CRISPR 技術(shù)經(jīng)常遭受所謂的 “脫靶效應(yīng)”，在這種情況下，序列被意外修改。新的結(jié)構(gòu)揭示了 Cascade 和 TniQ 如何協(xié)同工作，以確保只有正確的“目標(biāo)” 序列被標(biāo)記為 DNA 插入。研究人員計劃進一步探索這種檢查點，同時開發(fā)新的疾病治療工具。

哥倫比亞大學(xué)已經(jīng)提交了與這項工作相關(guān)的專利申請。據(jù)了解，Sam Sternberg 博士還是 Dahlia Biosciences 的聯(lián)合創(chuàng)始人和科學(xué)顧問，也是 Dahlia Biosciences 和 Caribou Biosciences 的股東。

來源：MIT科技評論