基因組編輯技術(shù)是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。在多種不同的基因組編輯方法中，以 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)最為便捷、高效，應(yīng)用也最廣泛。

但 CRISPR 技術(shù)存在的脫靶效應(yīng)依舊是影響其能否廣泛應(yīng)用的主要限制因素，如何正確評(píng)估、檢測(cè)脫靶效應(yīng)，并提出相應(yīng)的策略降低脫靶效應(yīng)，是當(dāng)前基因編輯研究領(lǐng)域的重要研究方向。

近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳改良團(tuán)隊(duì)一篇相關(guān)綜述，系統(tǒng)總結(jié)了當(dāng)前的基因編輯工具、基因編輯產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)及類型、脫靶效應(yīng)的機(jī)理、動(dòng)植物的脫靶效應(yīng)存在的問(wèn)題；并總結(jié)了如何進(jìn)行 sgRNA 設(shè)計(jì)、脫靶效應(yīng)的評(píng)估和預(yù)測(cè)、避免和減輕脫靶效應(yīng)的策略，及對(duì)預(yù)期基因組編輯結(jié)果的影響。該論文在線發(fā)表于國(guó)際綜合性期刊 Advanced Science。

基因編輯雖好 脫靶是個(gè)問(wèn)題

相對(duì)于以往研究基因功能的工具，以 CRISPR/Cas9 為代表的基因編輯技術(shù)效率和準(zhǔn)確性都較高，但也會(huì)帶來(lái)一個(gè)可能 “致命” 的問(wèn)題——脫靶效應(yīng)。

“基因編輯可以‘指哪打哪’。一般只要 20 個(gè)核苷酸序列就能對(duì)一個(gè)基因進(jìn)行定位并定點(diǎn)敲除。但同時(shí)，在基因組序列中，與特定 20 個(gè)核苷酸序列相近的堿基片段非常多?；蚓庉嬤^(guò)程中，與導(dǎo)向 RNA 靶向目標(biāo)很接近的片段，也會(huì)結(jié)合上去并被敲除掉，這就是所謂的‘脫靶’?！?華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授、論文共同通訊作者金雙俠在接受《中國(guó)科學(xué)報(bào)》采訪時(shí)解釋道。

金雙俠強(qiáng)調(diào)，由于可以結(jié)合的潛在脫靶位點(diǎn)基因片段較短，所以在理論上脫靶概率還是比較高的，脫靶位點(diǎn)也比較多。如果脫靶現(xiàn)象普遍發(fā)生，對(duì)動(dòng)植物來(lái)說(shuō)都會(huì)是一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，其后果是比較嚴(yán)重的。

在電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授張勇看來(lái)，基因組編輯技術(shù)在動(dòng)植物育種和基礎(chǔ)研究工作中都很重要。但其中的脫靶效應(yīng)和非特異性剪切對(duì)應(yīng)用結(jié)果和研究成果的可靠性、有用性有重要影響?！澳壳?，對(duì)于基因編輯技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展的綜述較多，但全面綜述脫靶效應(yīng)的比較少?！?/p>

“長(zhǎng)期以來(lái)，學(xué)術(shù)界對(duì)植物基因編輯器和基因編輯工具的脫靶效應(yīng)缺乏相關(guān)重視?！?安徽省作物基因編輯中心主任、安徽省農(nóng)科院水稻研究所研究員魏鵬程評(píng)價(jià)稱，該綜述很好地結(jié)合了動(dòng)物基因編輯技術(shù)中的前沿進(jìn)展和植物基因編輯所面臨的問(wèn)題，指出了未來(lái)在脫靶效應(yīng)方面到底應(yīng)該做哪些工作。

四種降低脫靶效應(yīng)的策略

根據(jù)該論文，基因編輯領(lǐng)域目前可以采用以下策略降低脫靶效應(yīng)：開(kāi)發(fā)并合理利用預(yù)測(cè)脫靶效應(yīng)的有效工具；開(kāi)發(fā)新的基因編輯系統(tǒng)；利用高質(zhì)量參考基因組設(shè)計(jì)靶標(biāo)；好的基因編輯工具遞送系統(tǒng)?！吧厦鎺追N技術(shù)策略的利用，可以有效減少或避免脫靶?！?金雙俠表示。

脫靶檢測(cè)最簡(jiǎn)單有效的方法之一是全基因組測(cè)序法。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)潛在的脫靶位點(diǎn)，然后將基因組測(cè)出來(lái)進(jìn)行比對(duì)。如果與受體材料相比，潛在脫靶位點(diǎn)沒(méi)有變化則證明沒(méi)有脫靶，有變化則有可能存在脫靶，進(jìn)一步可以通過(guò)經(jīng)典 Sanger 測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證?！斑@是目前非常簡(jiǎn)單高效且全面的一種方法?！?金雙俠稱。

開(kāi)發(fā)新的基因編輯系統(tǒng)，則是從技術(shù)源頭的角度避免脫靶。目前出現(xiàn)了一些新的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)，相比于最常用的 CRISPR/Cas 9 系統(tǒng)，有更高的精準(zhǔn)性可以顯著地降低脫靶效應(yīng)。

基因編輯中的基因組是通過(guò)基因組測(cè)序獲得的成千上萬(wàn)的小片段拼接而成，受早期測(cè)序技術(shù)和拼接策略的局限，很多物種的基因組早期版本有錯(cuò)誤。如果對(duì)這樣的基因組進(jìn)行編輯，就好比去解讀一本錯(cuò)誤百出的書(shū)，自然會(huì)產(chǎn)生誤解。所以，如果沒(méi)有很好的參考基因組，很容易產(chǎn)生脫靶。

“最理想的狀態(tài)是，做每一個(gè)品種的基因組編輯時(shí)，以該品種的參考基因組去做靶標(biāo)設(shè)計(jì)?！?金雙俠表示，即使是同一個(gè)物種，不同的品種、品系間都存在相當(dāng)大的遺傳差異，這會(huì)對(duì)脫靶、基因編輯精準(zhǔn)性產(chǎn)生很大影響。

好的基因編輯工具的傳遞系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)盡量避免或者降低組織培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞無(wú)性系變異，也是減少脫靶或者提高基因編輯精準(zhǔn)性的一個(gè)重要策略。

基因編輯工具未來(lái)前景

張勇認(rèn)為，該綜述對(duì)基本概念講得非常清楚，對(duì)方法的綜述非常全面。同時(shí)也非常貼近研究工作的實(shí)際?！安皇菑睦碚摰嚼碚摰?、讀完別人工作后做的文獻(xiàn)綜述，而是結(jié)合了第一線的工作?！?/p>

“該綜述通過(guò)總結(jié)現(xiàn)有研究工作，梳理了脫靶效應(yīng)這一概念的歷史，對(duì)脫靶效應(yīng)的概念進(jìn)行了比較系統(tǒng)和全面的分類。在方法層面比較全面系統(tǒng)闡述了怎樣從實(shí)驗(yàn)角度，用不同基因編輯技術(shù)檢測(cè)脫靶效應(yīng)的效率及可行性；用生物信息學(xué)、AI 數(shù)據(jù)分析等預(yù)測(cè)評(píng)估脫靶效應(yīng)；怎樣降低脫靶效應(yīng)、提高基因編輯的準(zhǔn)確性等問(wèn)題。” 張勇表示。

目前，基因編輯最主流的三種工具分別是鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)和串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas）系統(tǒng)。其中以 CRISPR/Cas 最高效、應(yīng)用最多，但其脫靶率相對(duì)來(lái)說(shuō)也最高。在準(zhǔn)確性方面，TELEN 的表現(xiàn)最好。

上世紀(jì) 90 年代開(kāi)始，生物界已經(jīng)開(kāi)始運(yùn)用 ZFN 技術(shù)。2000 年之后出現(xiàn) TALEN 技術(shù)?！霸缙诘幕蚓庉嫾夹g(shù)都是蛋白質(zhì)遞層，也就是說(shuō)要把蛋白質(zhì)遞到細(xì)胞里來(lái)，釋放蛋白質(zhì)的過(guò)程消耗的能量是非常大的?！?魏鵬程表示，雖然 TALEN 技術(shù)目前來(lái)看在保真性和精確程度上比 CRISPR/Cas 強(qiáng)，但從所消耗的能量和構(gòu)建藥品的成本上看，CRISPR/Cas 應(yīng)是基因編輯技術(shù)以后發(fā)展的一個(gè)重點(diǎn)。

“CRISPR/Cas 基因編輯工具目前所面臨的保真性和精確程度不足的問(wèn)題，在后續(xù)發(fā)展中應(yīng)該可以得到克服。” 魏鵬程據(jù)此判斷的理由是，早期的 CRISPR 蛋白主要從自然生物中去篩選，并沒(méi)有根據(jù)需要進(jìn)行人工選擇，因此能承受一部分的脫靶效應(yīng)。一旦把人工選擇加進(jìn)去之后，保真性很容易進(jìn)化出來(lái)?！皩?lái)隨著 CRISPR/Cas 技術(shù)的日臻完善，會(huì)把現(xiàn)有的一些問(wèn)題，比如保真性方面的缺陷給彌補(bǔ)上?！?/p>

金雙俠也認(rèn)為，雖然三種主流工具的應(yīng)用目前處于優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)狀態(tài)，有的科研機(jī)構(gòu)會(huì)同時(shí)使用這三種工具，但未來(lái)還是 CRISPR/Cas 更有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1002/advs.201902312

來(lái)源：中國(guó)科學(xué)報(bào)