基因組編輯技術(shù)是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。在多種不同的基因組編輯方法中，以 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)最為便捷、高效，應(yīng)用也最廣泛。

但 CRISPR 技術(shù)存在的脫靶效應(yīng)依舊是影響其能否廣泛應(yīng)用的主要限制因素，如何正確評估、檢測脫靶效應(yīng)，并提出相應(yīng)的策略降低脫靶效應(yīng)，是當(dāng)前基因編輯研究領(lǐng)域的重要研究方向。

近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳改良團隊一篇相關(guān)綜述，系統(tǒng)總結(jié)了當(dāng)前的基因編輯工具、基因編輯產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)及類型、脫靶效應(yīng)的機理、動植物的脫靶效應(yīng)存在的問題；并總結(jié)了如何進(jìn)行 sgRNA 設(shè)計、脫靶效應(yīng)的評估和預(yù)測、避免和減輕脫靶效應(yīng)的策略，及對預(yù)期基因組編輯結(jié)果的影響。該論文在線發(fā)表于國際綜合性期刊 Advanced Science。

基因編輯雖好 脫靶是個問題

相對于以往研究基因功能的工具，以 CRISPR/Cas9 為代表的基因編輯技術(shù)效率和準(zhǔn)確性都較高，但也會帶來一個可能 “致命” 的問題——脫靶效應(yīng)。

“基因編輯可以‘指哪打哪’。一般只要 20 個核苷酸序列就能對一個基因進(jìn)行定位并定點敲除。但同時，在基因組序列中，與特定 20 個核苷酸序列相近的堿基片段非常多。基因編輯過程中，與導(dǎo)向 RNA 靶向目標(biāo)很接近的片段，也會結(jié)合上去并被敲除掉，這就是所謂的‘脫靶’?！?華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授、論文共同通訊作者金雙俠在接受《中國科學(xué)報》采訪時解釋道。

金雙俠強調(diào)，由于可以結(jié)合的潛在脫靶位點基因片段較短，所以在理論上脫靶概率還是比較高的，脫靶位點也比較多。如果脫靶現(xiàn)象普遍發(fā)生，對動植物來說都會是一個嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，其后果是比較嚴(yán)重的。

在電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授張勇看來，基因組編輯技術(shù)在動植物育種和基礎(chǔ)研究工作中都很重要。但其中的脫靶效應(yīng)和非特異性剪切對應(yīng)用結(jié)果和研究成果的可靠性、有用性有重要影響。“目前，對于基因編輯技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展的綜述較多，但全面綜述脫靶效應(yīng)的比較少?！?/p>

“長期以來，學(xué)術(shù)界對植物基因編輯器和基因編輯工具的脫靶效應(yīng)缺乏相關(guān)重視?！?安徽省作物基因編輯中心主任、安徽省農(nóng)科院水稻研究所研究員魏鵬程評價稱，該綜述很好地結(jié)合了動物基因編輯技術(shù)中的前沿進(jìn)展和植物基因編輯所面臨的問題，指出了未來在脫靶效應(yīng)方面到底應(yīng)該做哪些工作。

四種降低脫靶效應(yīng)的策略

根據(jù)該論文，基因編輯領(lǐng)域目前可以采用以下策略降低脫靶效應(yīng)：開發(fā)并合理利用預(yù)測脫靶效應(yīng)的有效工具；開發(fā)新的基因編輯系統(tǒng)；利用高質(zhì)量參考基因組設(shè)計靶標(biāo)；好的基因編輯工具遞送系統(tǒng)?！吧厦鎺追N技術(shù)策略的利用，可以有效減少或避免脫靶。” 金雙俠表示。

脫靶檢測最簡單有效的方法之一是全基因組測序法。通過軟件預(yù)測潛在的脫靶位點，然后將基因組測出來進(jìn)行比對。如果與受體材料相比，潛在脫靶位點沒有變化則證明沒有脫靶，有變化則有可能存在脫靶，進(jìn)一步可以通過經(jīng)典 Sanger 測序法進(jìn)行驗證?！斑@是目前非常簡單高效且全面的一種方法?！?金雙俠稱。

開發(fā)新的基因編輯系統(tǒng)，則是從技術(shù)源頭的角度避免脫靶。目前出現(xiàn)了一些新的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)，相比于最常用的 CRISPR/Cas 9 系統(tǒng)，有更高的精準(zhǔn)性可以顯著地降低脫靶效應(yīng)。

基因編輯中的基因組是通過基因組測序獲得的成千上萬的小片段拼接而成，受早期測序技術(shù)和拼接策略的局限，很多物種的基因組早期版本有錯誤。如果對這樣的基因組進(jìn)行編輯，就好比去解讀一本錯誤百出的書，自然會產(chǎn)生誤解。所以，如果沒有很好的參考基因組，很容易產(chǎn)生脫靶。

“最理想的狀態(tài)是，做每一個品種的基因組編輯時，以該品種的參考基因組去做靶標(biāo)設(shè)計?！?金雙俠表示，即使是同一個物種，不同的品種、品系間都存在相當(dāng)大的遺傳差異，這會對脫靶、基因編輯精準(zhǔn)性產(chǎn)生很大影響。

好的基因編輯工具的傳遞系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)盡量避免或者降低組織培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞無性系變異，也是減少脫靶或者提高基因編輯精準(zhǔn)性的一個重要策略。

基因編輯工具未來前景

張勇認(rèn)為，該綜述對基本概念講得非常清楚，對方法的綜述非常全面。同時也非常貼近研究工作的實際?！安皇菑睦碚摰嚼碚摰?、讀完別人工作后做的文獻(xiàn)綜述，而是結(jié)合了第一線的工作。”

“該綜述通過總結(jié)現(xiàn)有研究工作，梳理了脫靶效應(yīng)這一概念的歷史，對脫靶效應(yīng)的概念進(jìn)行了比較系統(tǒng)和全面的分類。在方法層面比較全面系統(tǒng)闡述了怎樣從實驗角度，用不同基因編輯技術(shù)檢測脫靶效應(yīng)的效率及可行性；用生物信息學(xué)、AI 數(shù)據(jù)分析等預(yù)測評估脫靶效應(yīng)；怎樣降低脫靶效應(yīng)、提高基因編輯的準(zhǔn)確性等問題?！?張勇表示。

目前，基因編輯最主流的三種工具分別是鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）技術(shù)和串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas）系統(tǒng)。其中以 CRISPR/Cas 最高效、應(yīng)用最多，但其脫靶率相對來說也最高。在準(zhǔn)確性方面，TELEN 的表現(xiàn)最好。

上世紀(jì) 90 年代開始，生物界已經(jīng)開始運用 ZFN 技術(shù)。2000 年之后出現(xiàn) TALEN 技術(shù)?！霸缙诘幕蚓庉嫾夹g(shù)都是蛋白質(zhì)遞層，也就是說要把蛋白質(zhì)遞到細(xì)胞里來，釋放蛋白質(zhì)的過程消耗的能量是非常大的?！?魏鵬程表示，雖然 TALEN 技術(shù)目前來看在保真性和精確程度上比 CRISPR/Cas 強，但從所消耗的能量和構(gòu)建藥品的成本上看，CRISPR/Cas 應(yīng)是基因編輯技術(shù)以后發(fā)展的一個重點。

“CRISPR/Cas 基因編輯工具目前所面臨的保真性和精確程度不足的問題，在后續(xù)發(fā)展中應(yīng)該可以得到克服?！?魏鵬程據(jù)此判斷的理由是，早期的 CRISPR 蛋白主要從自然生物中去篩選，并沒有根據(jù)需要進(jìn)行人工選擇，因此能承受一部分的脫靶效應(yīng)。一旦把人工選擇加進(jìn)去之后，保真性很容易進(jìn)化出來。“將來隨著 CRISPR/Cas 技術(shù)的日臻完善，會把現(xiàn)有的一些問題，比如保真性方面的缺陷給彌補上?！?/p>

金雙俠也認(rèn)為，雖然三種主流工具的應(yīng)用目前處于優(yōu)勢互補狀態(tài)，有的科研機構(gòu)會同時使用這三種工具，但未來還是 CRISPR/Cas 更有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1002/advs.201902312

來源：中國科學(xué)報