針對新冠病毒核酸檢測檢出率低的問題，高盛生物公司深曉基因團(tuán)隊(duì)聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)文少卿教授，共同研發(fā)了新型2019-nCov捕獲測序試劑盒（TC-Seq），切實(shí)提高了新冠病毒核酸檢測的靈敏度和精確度。該試劑盒基于液相探針捕獲測序技術(shù)，除克服原有熒光定量PCR（RT-PCR）靈敏度低的缺點(diǎn)外，又有效降低了NGS(next-generation sequencing)技術(shù)，即下一代測序技術(shù)/高通量測序技術(shù)的成本，可為新冠病毒病例的陰陽性判定、病毒的長期監(jiān)測乃至病毒變異遺傳圖譜分析等工作，提供了強(qiáng)大而精準(zhǔn)的“火力”。1?新冠病毒變異多檢驗(yàn)難度大，熒光定量PCR僅能實(shí)現(xiàn)30–50%檢出率
冠狀病毒（2019-nCov）為單鏈正鏈RNA病毒，該類病毒具有傳播能力強(qiáng)、變異迅速的特點(diǎn)。隨著疫情的發(fā)展，現(xiàn)階段一方面需要準(zhǔn)確診斷病毒感染，一方面需要對病毒株是否發(fā)生變異進(jìn)行監(jiān)控。根據(jù)變異預(yù)測病毒的感染及致病力，提前預(yù)警并做出針對性的預(yù)案，同時(shí)為后期有效治療提供研究基礎(chǔ)。
新冠病毒RT-PCR是主流檢驗(yàn)方法，但檢驗(yàn)準(zhǔn)確度低也是困擾臨床診治的大問題熒光定量檢測（RT-PCR）是目前核酸法檢測速度中最快速的方法，主要針對的位點(diǎn)包含病毒基因組中3段保守基因序列，即開放讀碼框1ab（Open reading frame 1ab，ORF1ab）、 核 殼 蛋 白 （Nucleocapsid protein，N）基因以及包膜蛋白(Envelop，E)基因作為檢測靶標(biāo)。根據(jù)國家衛(wèi)健委發(fā)布的新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南（第四版），在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)病例為陽性，需滿足同一份標(biāo)本中新冠病毒的ORF1ab及N基因 2個(gè)靶標(biāo)特異性實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性。如受實(shí)驗(yàn)室檢測試劑盒限制，只能做一個(gè)靶標(biāo)的檢測的話，應(yīng)至少針對新冠病毒最為保守及特異的ORF1ab區(qū)域進(jìn)行檢測。特別是武漢的復(fù)合感染無法用單一的PCR一次鑒定完成。因此，鑒定新冠病毒RT-PCR法往往具有以下不足：
- 對病毒基因組的富集存在明顯的偏向性；
- 依賴病毒序列多樣性的前期基礎(chǔ)，現(xiàn)在前期積累不足，只擴(kuò)增所謂的特異性區(qū)域有可能引起假陽性的問題；
- 病毒快速突變下會(huì)導(dǎo)致脫靶率高，引發(fā)假陰性的問題；
- 該方法需要一定的起始量，敏感度較低，會(huì)進(jìn)一步放大假陰性的問題。
除了RT-PCR技術(shù)先天不足外，要解決咽拭子采樣核酸檢測往往只有50%?甚至更低的檢出率的問題，臨床檢驗(yàn)上至少要實(shí)現(xiàn)三個(gè)方面的有效改進(jìn)，
- 需提高咽拭子采集的規(guī)范化，
- 要將樣本采集部位進(jìn)行交叉驗(yàn)證，如血液、尿液、肛拭子等，
- 要切實(shí)核酸試劑本身提高敏感度。
2?NGS (next-generation sequencing)的不足
提高檢測靈敏度的方法，可通過高通量基因測序技術(shù)中的宏基因組測序mNGS技術(shù)，全面分析新冠病毒基因?qū)σ伤撇』歼M(jìn)行確診，并對變異病毒進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)控等。但是mNGS相對RT-PCR的成本高（由于患者樣本中不可避免存在大量的人類核酸污染），病毒序列的有效數(shù)據(jù)量低，一次上機(jī)測序的樣本數(shù)量也相對有限。這就影響了新冠病毒基因數(shù)據(jù)的質(zhì)量和產(chǎn)量，不利于臨床檢驗(yàn)結(jié)果的判讀，以及配合檢測人員快速建立高質(zhì)量的新冠病毒“檔案庫”。
mNGS精確度高，但進(jìn)入臨床檢驗(yàn)還有待時(shí)日
深曉基因及復(fù)旦大學(xué)文教授聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)研發(fā)的2019-nCov捕獲測序（TC-Seq）試劑盒的出現(xiàn)，解決了上述難題。該試劑盒可高效捕獲所有新冠病毒核酸全序列，以及其他可能感染源（如甲流，乙流等）序列后再進(jìn)行上機(jī)測序，相對于已有RT-PCR法可極大提高序列分析的準(zhǔn)確性！而相對于已有的NGS方法，則可有效縮短序列分析時(shí)間，降低測序成本！同時(shí)，新試劑盒可方便地承擔(dān)病毒的變異監(jiān)測、進(jìn)化演變、致病力分析等工作。
2019-nCov捕獲測序（TC-Seq）試劑盒技術(shù)示意圖
高盛生物深曉基因2019-nCov捕獲測序（TC-Seq）試劑盒
深曉基因新冠病毒（TC-Seq）試劑盒的技術(shù)特征：
- 基本涵蓋新冠病毒變異株系，不怕病毒變異：DNA探針，2X以上覆蓋設(shè)計(jì)；涵蓋了50+株系，對有明顯變異的株系額外增加了探針覆蓋；
- 探針可以靈活spike in，具有靈活拓展性：后期可將根據(jù)新發(fā)現(xiàn)的株系設(shè)計(jì)的探針整合進(jìn)已有panel，捕獲體系兼容市面DNA探針捕獲系統(tǒng)；
- 同時(shí)兼容MGI/Illumina NGS等測序平臺；探針池設(shè)有捕獲內(nèi)參基因，RNA樣本和DNA樣本均可適用；
- 極高的靈敏度：可檢測的病毒含量下限為 10 拷的樣本，當(dāng)熒光定量PCR 檢測失敗時(shí)，本試劑盒也可檢測到病毒序列，判斷受試者是否感染新冠；當(dāng)樣本中病毒拷貝達(dá)到 1000 個(gè)時(shí)，即可基本復(fù)原基因組（覆蓋度＞90%）；
- 可同時(shí)實(shí)現(xiàn)同源性病毒的檢測和篩查：可檢測到基因組相似度超過75%的其他種類的病毒；這對于癥狀相近的疑似患者隔離和診斷尤為重要。
- 數(shù)據(jù)兼容好，可方便兼容從提取到數(shù)據(jù)產(chǎn)出的全流程國產(chǎn)化方案。
4?深曉基因2019-nCov捕獲測序（TC-Seq）試劑盒的實(shí)戰(zhàn)表現(xiàn)及展望
在新冠疫情發(fā)生后，高盛生物深曉基因團(tuán)隊(duì)迅速與某疾控中心建立了合作關(guān)系，檢測了大量陽性樣本，發(fā)現(xiàn)許多弱陽性樣本（核酸檢測ct值大于32以上的樣本）使用宏基因測序僅能獲得不完整的新冠病毒基因序列。
上圖統(tǒng)計(jì)了非GISAID數(shù)據(jù)，共計(jì)98條完整或不完整序列。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來源：https://bigd.big.ac.cn/ncov）
深曉團(tuán)隊(duì)采用2019-nCov捕獲測序（TC-Seq）試劑盒，與合作單位針對包括弱陽性樣本在內(nèi)的多種類型樣本進(jìn)行捕獲測序，獲得盡可能多的病毒基因序列，既可實(shí)現(xiàn)新冠病毒的精確性檢測，又能為針對新冠病毒的多項(xiàng)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為新冠病毒的長期監(jiān)測提供技術(shù)支撐。
深曉團(tuán)隊(duì)使用本試劑盒對某地疾病預(yù)防控制中心提供的樣本進(jìn)行建庫并測序，得到了高深度、高覆蓋度的新冠病毒全長序列數(shù)據(jù)。更多樣本的數(shù)據(jù)正在生成中。
在未來積累了足夠多的新冠病毒數(shù)據(jù)量之后，運(yùn)用基因大數(shù)據(jù)，深曉團(tuán)隊(duì)的分析結(jié)論將更加精準(zhǔn)，整體方案更加靈敏。預(yù)計(jì)該項(xiàng)工作的下一階段，可將新冠病毒的檢測靈敏度提升至10拷貝/毫升，從而實(shí)現(xiàn)對所有病毒核酸檢測Ct在37-40范圍內(nèi)的弱陽性樣本的復(fù)檢，徹底杜絕疑似病人在病原學(xué)上的漏檢，實(shí)現(xiàn)新冠病毒核酸檢驗(yàn)100%準(zhǔn)確率的目標(biāo)。5?軟硬結(jié)合，深曉團(tuán)隊(duì)的TC-Seq試劑盒可與高盛智造核酸提取平臺實(shí)現(xiàn)
高通量自動(dòng)化檢測
深曉團(tuán)隊(duì)測序（TC-Seq）的前處理，可結(jié)合高盛制造已有的自動(dòng)化平臺，建立從核酸提取、定量、反轉(zhuǎn)錄、液相探針捕獲建庫、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)分析等全套流程，實(shí)現(xiàn)配合多種病原的一次性多重檢測，單樣品檢測涵蓋已知冠狀病毒+新型冠狀病毒2019-nCoV的全序列的高通量自動(dòng)化檢測。
高盛智造的X-PURE96 PLUS配合深曉基因的TC-Seq試劑盒，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高通量高精度檢驗(yàn)
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