近日，《自然》雜志正式發(fā)表醫(yī)學院李海濤課題組和耶魯大學蕭琢（Andrew Z. Xiao）實驗室題為“N⁶-methyladenine in DNA antagonizes SATB1 in early development”（DNA N⁶-甲基腺嘌呤（6mA）在早期發(fā)育過程中拮抗SATB1）的合作文章。該論文發(fā)現(xiàn)DNA 6mA修飾可以拮抗基因組組織蛋白SATB1在SIDD（壓力誘導的DNA雙螺旋失穩(wěn)）區(qū)結合，從而調控染色質結構并影響早期胚胎發(fā)育。

圖1? DNA 6mA修飾拮抗SATB1調節(jié)早期發(fā)育

6mA修飾是近年來在哺乳動物基因組中鑒定出的新型DNA甲基化修飾，被稱為基因組第九堿基，但其豐度、分布和產生方式等在領域內仍存爭議，亟需深入細致的機制性研究突破。

2016年，耶魯大學干細胞中心的蕭琢教授首次在Alkbh1缺陷型小鼠胚胎干細胞中鑒定出DNA 6mA的存在，并發(fā)現(xiàn)其對轉座元件如LINE-1的表觀沉默功能（Wu et al，Nature 2016）。2018年，蕭琢實驗室與加利福尼亞大學圣迭戈分校（UCSD）的Jeremy Rich實驗室合作發(fā)現(xiàn)人類神經膠質瘤干細胞基因組中有著豐富的6mA修飾，參與癌癥的發(fā)展，因此靶向ALKBH1有望成為治療神經膠質瘤新策略 （Xie et al，Cell 2018）。李海濤課題組與蕭琢實驗室自2015年就開始了6mA修飾相關的合作研究。歷經數(shù)年積累，今年年初在我國自己主辦的高影響力學術雜志《細胞研究》（Zhang et al，Cell Res 2020）發(fā)表合作論文，通過系統(tǒng)的生化和復合物結構解析，發(fā)現(xiàn)ALKBH1偏好催化“鼓泡”狀態(tài)的DNA 6mA修飾，首次揭示哺乳動物基因組6mA酶促消除的分子基礎。

基因組容易發(fā)生局部開鏈的“鼓泡”區(qū)域正是AT富集的SIDD區(qū)域。該區(qū)域富含核基質附著區(qū)（matrix attachment regions，MARs) DNA基序（motif），可通過介導基因組與核基質的相互作用，參與染色質高維結構組織，對轉錄、復制等過程有著重要調控作用。在這一過程中，圍繞6mA修飾的識別與催化事件發(fā)揮什么作用？其在早期胚胎發(fā)育過程中有何功能？《自然》發(fā)表的本項工作即圍繞這些科學問題展開。

由于6mA在小鼠胚胎干細胞（mES）中豐度較低（百萬分之6-7），研究者首先尋找適宜的細胞培養(yǎng)條件來提高6mA含量。值得注意的是，在四倍體補償實驗（tetraploid complementation，4N）中，6mA豐度與不同培養(yǎng)條件下mES的發(fā)育潛力呈正比。也就是說，在傳統(tǒng)的2i（加入ERF和GSK3b抑制劑）條件中（4N陰性），6mA水平顯著降低；而在其他2i條件下（4N陽性），6mA的水平則得以保留。mES細胞培養(yǎng)條件的差異可能是造成不同課題組關于6mA豐度爭議的原因。mES的發(fā)育潛力與其細胞重編程狀態(tài)密切相關，這也提示了6mA在早期發(fā)育過程中的重要作用。

圖2? 基因組6mA的動態(tài)調節(jié)及其SIDD分布

隨后，研究者利用胚內向胚外組織的干細胞轉分化系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)6mA豐度在小鼠滋養(yǎng)層干細胞(trophoblast stem cell，TSC)形成過程中有明顯升高，隨后下降（圖2a）。更有意思的是，作者發(fā)現(xiàn)6mA在基因組分布不是隨機的。通過MAR DNA抽提和質譜鑒定發(fā)現(xiàn)6mA修飾富集在核基質附著區(qū)DNA，且在轉分化進程第5天明顯上調（圖2b）。進一步的DNA免疫共沉淀測序（DIP-seq）發(fā)現(xiàn)6mA主要位于AT含量高的基因間區(qū)域（intergenic regions），比如轉座子LINE-1s；特別地，進一步分析顯示超過60%的6mA位于SSID區(qū)（圖2c）。SSID區(qū)有助于推動拓撲壓力誘導的DNA雙螺旋不穩(wěn)定，對染色質結構的組織有重要作用，包括建立和維持異染色質-常染色質邊界和DNA的長距離互作等。其中SATB1是SSID調節(jié)蛋白，可以直接結合MAR基序組織染色質高級結構。

?圖3? 基因組6mA拮抗SATB1結合

那么，6mA是否會影響調節(jié)蛋白，比如SATB1，在SSID區(qū)的結合呢？確實，結構分析與結合實驗顯示在體外條件下，6mA都能顯著的阻礙SATB1對DNA的結合（圖3a，3b）。ChIP-seq數(shù)據(jù)分析表明，SATB1的基因組定位與6mA的基因組分布呈現(xiàn)互斥關系（圖3c），而過表達6mA去甲基化酶ALKBH1后可以顯著上調SATB1基因組定位。隨后研究者利用ATAC-seq手段探討染色質開放程度與6mA修飾的關系。結果發(fā)現(xiàn)6mA修飾降低位點的染色質變得更加開放，異染色質區(qū)域也被打開。Alkbh1過表達后染色質可及區(qū)域則會蔓延過6mA修飾所在的邊界。同時體內實驗證明過表達活性Alkbh1而非酶活缺陷Alkbh1可以促進滋養(yǎng)層巨細胞（trophoblast giant cell，TGC）的形成。這說明6mA通過拮抗SATB1維持染色質的常染色質-異染色質邊界，調控周邊基因的表達，進而影響TSC的形成。

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圖4? 6mA調控小鼠早期胚胎發(fā)育

為進一步研究6mA在胚胎發(fā)育中的功能，研究者構建了ALKBH1缺失的小鼠。雖然ALKBH1缺失的雜合小鼠可以出生，但是純和小鼠卻不能。ALKBH1缺失會增加胎盤組織6mA修飾水平并抑制TSC向TGC的分化，顯著減少TGC形成（圖4a，4b）。同時，SATB1的敲除也有與ALKBH1缺失相似的表型，該表型可以被野生型SATB1回補，同時更能被容忍6mA修飾的SATB1改造突變體有效回補（圖4c），說明6mA主要通過拮抗SATB1結合發(fā)揮功能。

總的來說，該研究發(fā)現(xiàn)6mA通過拮抗SATB1在發(fā)育的早期調節(jié)染色質結構，為研究表觀遺傳修飾調控染色質結構和基因表達提供了新的思路，具有重要意義。

清華大學李海濤教授與耶魯大學蕭琢教授為文章共同通訊作者，李海濤教授實驗室已畢業(yè)學生趙帥博士為文章的共同第一作者，李海濤教授實驗室張敏博士參與了本項工作。本項目得到了國家自然科學基金委員會，科技部重大研究計劃，北京結構生物學高精尖創(chuàng)新中心，北京生物結構前沿研究中心，以及清華-北大生命科學聯(lián)合中心的支持。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2500-9

來源：清華大學醫(yī)學院