高等生物能夠在環(huán)境因素刺激下，快速誘導(dǎo)特定基因的表達，保證了炎癥反應(yīng)、熱休克應(yīng)激等諸多細胞過程的發(fā)生。以組蛋白修飾和DNA甲基化為代表的表觀機制是真核生物進化出來的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控策略。那么在刺激誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄過程中，是否存在標(biāo)志性表觀修飾參與其中并發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用呢？

北京時間2020年7月30日，清華大學(xué)李海濤團隊攜手美國威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院Steven Josefowicz實驗室、洛克菲勒大學(xué)C David Allis實驗室等在《自然》雜志（《Nature》）正式發(fā)表題為“Histone H3.3 phosphorylation amplifies stimulation-induced transcription”（組蛋白H3.3磷酸化增強刺激誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄） 的研究論文。研究團隊利用內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細胞炎性反應(yīng)模型，從生物化學(xué)、功能基因組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度系統(tǒng)揭示了組蛋白變體H3.3第31位絲氨酸磷酸化（H3.3S31ph）在刺激誘導(dǎo)型快速轉(zhuǎn)錄延伸過程中標(biāo)志性調(diào)控作用。

組蛋白H3.3是一類保守的“祖先級”組蛋白H3變體，是單細胞真核生物如酵母中的唯一組蛋白H3形式。與高等生物中復(fù)制依賴的組蛋白變體H3.1不同，組蛋白變體H3.3主要參與染色質(zhì)動態(tài)活動調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)和有絲分裂等過程中發(fā)揮著重要作用。組蛋白變體H3.3 與“經(jīng)典”的組蛋白H3.1或H3.2的一個重要區(qū)別在于其氨基端第31位殘基為絲氨酸(Ser或S)， 而H3.1/2為丙氨酸(Ala或A)。這一氨基酸組成差異對于組蛋白H3.3的功能發(fā)揮有何意義是一個領(lǐng)域關(guān)注熱點。

2014年，李海濤團隊與美國MD Anderson癌癥中心的石曉冰教授實驗室曾在《自然》發(fā)表合作文章，首次發(fā)現(xiàn)抑癌因子ZMYND11是新型H3.3變體賴氨酸36三甲基化（H3.3K36me3）識別因子，并揭示其在抑制轉(zhuǎn)錄延伸過度活化方面的功能。在這一過程中，絲氨酸31因為其有別于丙氨酸31的氫鍵形成能力，貢獻了ZMYND11對H3.3的特異識別。H3.3的第31位絲氨酸還可以被磷酸化，然而H3.3S31ph的功能與生物物理機制還需要進一步研究。

已知巨噬細胞被細菌脂多糖（LPS）刺激后，可以在數(shù)分鐘至一個小時內(nèi)，快速上調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達。在本工作中，作者發(fā)現(xiàn)在LPS刺激后，巨噬細胞中組蛋白H3.3的S31和S28位點磷酸化修飾水平顯著上升，類似現(xiàn)象在其他細胞類型如DC細胞、NK細胞、B細胞和神經(jīng)細胞等的刺激響應(yīng)過程中保守存在。進一步對巨噬細胞進行RNA-seq和ChIP-seq分析，驚奇發(fā)現(xiàn)H3.3S31ph富集存在于LPS導(dǎo)基因的基因體（gene body）區(qū)，而H3S28ph則呈互補分布，主要存在于基因增強子、啟動子、以及基因間區(qū)等區(qū)域。分別對ChIP-seq結(jié)果進行獨立的peak calling和density rank order分析，作者發(fā)現(xiàn)H3.3S31ph修飾特異性地附著在刺激誘導(dǎo)表達型基因，而并非廣譜性地結(jié)合持續(xù)表達型基因。

那么什么上游激酶催化了H3.3S31磷酸化修飾呢？作者根據(jù)ChIP-seq結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)很多刺激轉(zhuǎn)錄的基因都是NF-kB信號通路的靶基因，并且受已知的H3.3S31激酶CHK1的干擾較小，據(jù)此作者猜測產(chǎn)生H3.3S31ph修飾的激酶可能是NF-kB信號通路中的關(guān)鍵激酶IKKa。進一步研究發(fā)現(xiàn)，IKKa會在細胞受到刺激后定位到H3.3S31ph靶基因附近；加入IKKa特異抑制劑或?qū)ζ溥M行小RNA干擾敲降，會導(dǎo)致靶基因周圍H3.3S31ph水平的顯著降低，表明IKKa是該過程中產(chǎn)生H3.3S31ph修飾的激酶。

同時，作者發(fā)現(xiàn)H3K36me3而非H3K36me2修飾在刺激誘導(dǎo)型基因上的定位與H3.3S31ph高度重合，且同步上調(diào)。在高等動物中，只有SETD2甲基轉(zhuǎn)移酶能夠完成H3K36位點的三甲基化， 而其他同源酶例如NSD2只能完成二甲基化。

李海濤團隊曾在2016年在Genes Dev發(fā)文首次解析出SETD2結(jié)合組蛋白底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，發(fā)現(xiàn)H3S31位點位于一個正電荷富集區(qū)，這對于結(jié)合帶有負電荷的H3.3S31ph修飾極為有利。通過體外酶活實驗，作者發(fā)現(xiàn)H3.3S31的磷酸化修飾能夠提高SETD2的甲基轉(zhuǎn)移活力，對NSD2則沒有促進作用。進一步的復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析證明H3.3S31ph的磷酸基團與SETD2的兩個堿性殘基K1600和K1673存在靜電吸引和水介導(dǎo)的氫鍵作用，進而揭示了H3.3S31ph促進SETD2酶活的分子基礎(chǔ)。有意思的是，序列分析表明K1600和K1673殘基只在SETD2中存在且相當(dāng)保守，而在NSD2等其他酶中則被替換為酸性或極性氨基酸，這也就完美解釋了為什么H3.3S31ph不能促進與NSD2直接相關(guān)的組蛋白H3.3K36me2的修飾水平。

綜上所述，生化與結(jié)構(gòu)實驗共同揭示出一種H3.3S31ph順式激活H3.3K36me3酶促產(chǎn)生的組蛋白修飾交叉會話機制。

已知腫瘤抑制因子ZMYND11能夠特異性地識別H3.3K36me3修飾，抑制轉(zhuǎn)錄延伸的過度活化。在本文中，作者通過結(jié)合結(jié)構(gòu)分析、ITC滴定、以及ZMYND11的ChIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)H3.3S31位點產(chǎn)生磷酸化后會因為體積排斥效應(yīng)，“踢走”原本結(jié)合的ZMYND11，從而解除轉(zhuǎn)錄延伸共抑制子ZMYND11的抑制效應(yīng)，促進了H3.3S31ph靶基因的活躍轉(zhuǎn)錄。本部分工作揭示出了一種H3.3S31ph對于H3.3K36me3修飾識別的二元開關(guān)（binary switch）調(diào)控機制。

總而言之，該研究對刺激誘導(dǎo)型基因的轉(zhuǎn)錄延伸機制從表觀遺傳層面進行了解析。刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的組蛋白H3.3S31ph修飾富集在基因體區(qū)，一方面促進了組蛋白H3.3K36me3修飾“書寫器”（writer）SETD2的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，促進了轉(zhuǎn)錄延伸；另一方面拮抗了組蛋白H3.3K36me3修飾“閱讀器”（reader）ZMYND11的結(jié)合，解除了其轉(zhuǎn)錄延伸共抑制。上述表觀遺傳機制使得細胞能夠更好地響應(yīng)與適應(yīng)環(huán)境刺激，保證了刺激誘導(dǎo)型基因的快速表達?？焖夙憫?yīng)外界刺激并啟動特定基因轉(zhuǎn)錄與多種細胞反應(yīng)和疾病相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3.3S31磷酸化是開啟特異性轉(zhuǎn)錄延伸激活的關(guān)鍵，為相關(guān)疾病治療提供了新視角和新靶點。

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤教授與美國康奈爾醫(yī)學(xué)院Steven Josefowicz助理教授是本論文的共同通訊作者。洛克菲勒大學(xué)C David Allis教授實驗室博士后Anja Armache博士和李海濤教授實驗室已畢業(yè)研究生楊爽博士為本論文共同第一作者，李海濤教授實驗室岳媛博士參加了本項工作。本項目得到了國家自然科學(xué)基金委員會、科技部重大研究計劃、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心以及上海同步輻射光源的支持。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2533-0

來源：清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院