植物先天免疫是植物在與病原微生物長(zhǎng)期共同進(jìn)化的過(guò)程中逐漸形成的免疫對(duì)抗機(jī)制，用來(lái)抵抗病原微生物的侵害。其中一類重要組成部分是效應(yīng)蛋白引起的先天免疫（Effector-Triggered Immunity, ETI）。NLR（Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing receptor）是調(diào)節(jié)ETI的一類主要受體蛋白。根據(jù)其N(xiāo)端結(jié)構(gòu)域，NLR主要分為兩類：CNL (CC-NB-LRR)?和TNL (TIR-NB-LRR)【1】。這兩類受體蛋白都可以直接或者間接地識(shí)別病原菌效應(yīng)蛋白進(jìn)而引起ETI【2】。柴繼杰實(shí)驗(yàn)室去年的研究成果表明，擬南芥的CNL抗病蛋白ZAR1，識(shí)別效應(yīng)蛋白后可以形成抗病小體?(Resistosome)。ZAR1抗病小體可能作為離子通道或者轉(zhuǎn)運(yùn)通道引起ETI【3,4】，相比CNL，TNL的作用機(jī)制更為復(fù)雜。TNL的N端TIR結(jié)構(gòu)域具有NAD＋水解酶活性（NADase）。該活性被認(rèn)為用以產(chǎn)生第二信使信號(hào)，激活下游的EDS1、NRG1等免疫通路【5-7】。目前還有很多TNL信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)問(wèn)題有待回答。例如TNL如何識(shí)別效應(yīng)蛋白？TNL是否可以形成抗病小體？識(shí)別效應(yīng)蛋白對(duì)TIR的NAD＋水解活性是否有調(diào)節(jié)作用？

之前的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的RPP1是TNL類抗病蛋白的典型代表，主要由N端TIR結(jié)構(gòu)域、中間NOD (Nucleotide binding oligomerization domain)?結(jié)構(gòu)域以及C端亮氨酸重復(fù)?(Leucine rich repeat, LRR)?結(jié)構(gòu)域組成。植物葉片在被植物病原菌Hyaloperonospora arabidopsis侵染過(guò)程中會(huì)分泌一類效應(yīng)蛋白ATR1，RPP1通過(guò)識(shí)別ATR1繼而引起ETI【8】。

2020年12月4日，結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心柴繼杰課題組和德國(guó)馬克斯-普朗克植物育種研究所Jane Parker課題組、Paul Schulze-Lefert課題組合作在Science?發(fā)表了題為Direct pathogen-induced assembly of an NLR immune receptor complex to form a holoenzyme?的研究論文，首次揭示了植物TNL類抗病蛋白R(shí)PP1直接識(shí)別其效應(yīng)蛋白ATR1后激活并形成全酶的分子機(jī)制。此外，Science同期還配發(fā)了題為Enzyme formation by immune receptors的評(píng)論文章。

科研成果 | 清華大學(xué)柴繼杰課題組與合作者首次揭示植物TNL類抗病蛋白激活的分子機(jī)制-肽度TIMEDOO科研成果 | 清華大學(xué)柴繼杰課題組與合作者首次揭示植物TNL類抗病蛋白激活的分子機(jī)制-肽度TIMEDOO
01
RPP1抗病小體結(jié)構(gòu)的解析
該研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)（Spodoptera frugiperda）細(xì)胞里重組共表達(dá)了TNL類抗病蛋白R(shí)PP1與其效應(yīng)蛋白ATR1，通過(guò)串聯(lián)純化的方法得到了高純度的激活狀態(tài)RPP1-ATR1復(fù)合物，命名為RPP1抗病小體（RPP1 resistosome）。通過(guò)冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)，成功解析了RPP1結(jié)合ATR1形成四聚體激活狀態(tài)的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，分辨率為3.16 ?（圖1），并結(jié)合遺傳學(xué)和生物化學(xué)的手段進(jìn)一步闡釋了它發(fā)揮功能的具體機(jī)制。
科研成果 | 清華大學(xué)柴繼杰課題組與合作者首次揭示植物TNL類抗病蛋白激活的分子機(jī)制-肽度TIMEDOO
?圖1 ?RPP1抗病小體四聚體結(jié)構(gòu)
02
RPP1抗病小體結(jié)構(gòu)的解析
電鏡結(jié)構(gòu)顯示RPP1的LRR結(jié)構(gòu)域直接參與ATR1的結(jié)合。除此之外，結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)RPP1的C末端有一個(gè)新的結(jié)構(gòu)域C-JID（C-terminal jell roll and Ig-like domain）也直接參與ATR1的直接識(shí)別。進(jìn)一步分析表明，C-JID幾乎存在于所有的TNL中，暗示該結(jié)構(gòu)域可能對(duì)TNL識(shí)別配體具有廣譜作用。RPP1識(shí)別ATR1引起自身構(gòu)象變化，從而解除分子內(nèi)自抑制，形成四聚體的激活狀態(tài)。該結(jié)構(gòu)為NLR直接識(shí)別效應(yīng)蛋白的假說(shuō)提供了有力證據(jù)。
03
RPP1抗病小體以全酶狀態(tài)催化

NAD＋水解機(jī)制的發(fā)現(xiàn)

生化分析表明RPP1抗病小體的形成可以極大地促進(jìn)NAD＋水解活性，并且二價(jià)金屬離子如鎂離子以及鈣離子可以進(jìn)一步促進(jìn)該活性。結(jié)構(gòu)分析顯示了RPP1抗病小體作為一個(gè)全酶催化NAD＋水解的機(jī)制。有別于其它C4對(duì)稱性的結(jié)構(gòu)域，抗病小體中的4個(gè)TIR結(jié)構(gòu)域采用C2對(duì)稱性，即兩個(gè)TIR結(jié)構(gòu)域通過(guò)類平移對(duì)稱形成頭對(duì)尾的二聚體，在此基礎(chǔ)上兩個(gè)二聚體再通過(guò)C2對(duì)稱形成四聚體。多方面證據(jù)支持RPP1抗病小體中的兩個(gè)頭對(duì)尾的二聚TIR作為完整的NADase催化NAD＋水解。首先，一個(gè)ATP分子結(jié)合在一個(gè)頭對(duì)尾的二聚TIR中；其次，結(jié)構(gòu)比較顯示該ATP分子與TIR的另外一種底物NADP+具有相似的結(jié)合位點(diǎn)；最后，BB-loop對(duì)于形成頭對(duì)尾的TIR二聚體具有重要作用，而突變?cè)搇oop上的關(guān)鍵氨基酸極大降低RPP1抗病小體的NAD＋水解活性以及ATR1誘導(dǎo)的ETI活性。
04
RPP1抗病小體結(jié)合ADP，而非ATP/dATP
關(guān)于NLR受體活化，目前一個(gè)普遍被接受的觀點(diǎn)是配體結(jié)合后促進(jìn)ATP/dATP交換抑制態(tài)中的ADP分子（結(jié)合于NOD結(jié)構(gòu)域），從而引起NLR的寡聚化。然而令人吃驚的是，RPP1抗病小體的NOD結(jié)構(gòu)域結(jié)合的是ADP，而非ZAR1抗病小體中的ATP/dATP。蛋白質(zhì)序列分析表明，ZAR1利用CNL高度保守 “TTR” 基序中的R（精氨酸）與ATP/dATP的γ-磷酸基團(tuán)結(jié)合，從而穩(wěn)定其激活構(gòu)象。生化以及遺傳數(shù)據(jù)表明該精氨酸對(duì)ZAR1抗病小體功能具有關(guān)鍵作用。但是該基序中R在RPP1發(fā)生了突變，從而使其失去ATP結(jié)合活性。但是這一現(xiàn)象的生物學(xué)意義目前尚不清楚，值得將來(lái)進(jìn)一步研究。

綜上所述，該研究首次報(bào)道了植物TNL類抗病蛋白R(shí)PP1直接識(shí)別并結(jié)合效應(yīng)蛋白ATR1、形成抗病小體并作為全酶促進(jìn)NAD+水解的分子機(jī)制。這些結(jié)果促進(jìn)了TNL下游免疫通路信號(hào)傳遞機(jī)制的研究，為理解植物TNL類抗病蛋白活化機(jī)制提供了范式。

柴繼杰課題組一直致力于NLR家族受體的作用機(jī)制。繼此前揭示了CNL類受體ZAR1的自抑制與活化機(jī)制后，此次又首次報(bào)道了TNL受體RPP1配體識(shí)別以及活化的分子機(jī)制。作為植物兩大類NLR受體CNL和TNL的代表，ZAR1與RPP1的研究成果是植物抗病蛋白研究領(lǐng)域數(shù)十年來(lái)一直期待的重大突破。

清華大學(xué)生命學(xué)院13級(jí)博士研究生馬守偲、德國(guó)馬克斯-普朗克植物育種研究所博士后Dmitry Lapin、劉莉，清華大學(xué)生命學(xué)院18級(jí)博士研究生孫玥和德國(guó)科隆大學(xué)博士后宋文為本文的共同第一作者。結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心柴繼杰教授、德國(guó)馬克斯-普朗克植物育種研究所的Jane Parker教授和Paul Schulze-Lefert教授為本文共同通訊作者。北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心已出站博士后張曉驍，德國(guó)馬克斯-普朗克植物育種研究所的Elke Logemann、于東立，德國(guó)科隆大學(xué)的Jan Jirschitzka，結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心王家、副研究員韓志富也參與了本項(xiàng)研究。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、德國(guó)洪堡基金會(huì)和德國(guó)科學(xué)基金會(huì)的經(jīng)費(fèi)支持。

參考文獻(xiàn)

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【3】J. Wang et al., Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity. Science 364, eaav5870 (2019).

【4】J. Wang et al., Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex. Science 364, eaav5868 (2019).

【5】L. Wan et al., TIR domains of plant immune receptors are NAD(+)-cleaving enzymes that promote cell death. Science 365, 799-803 (2019).

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【7】D. Lapin et al., A Coevolved EDS1-SAG101-NRG1 Module Mediates Cell Death Signaling by TIR-Domain Immune Receptors. The Plant cell 31, 2430-2455 (2019).

【8】M. A. Botella et al., Three genes of the Arabidopsis RPP1 complex resistance locus recognize distinct Peronospora parasitica avirulence determinants. The Plant cell 10, 1847-1860 (1998).

論文鏈接

https://science.sciencemag.org/content/370/6521/eabe3069

來(lái)源：結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心