鈉通道NALCN復合體主要位于神經(jīng)元細胞膜上，介導了電壓調(diào)控、胞外鈣離子阻塞的鈉漏電流，使靜息電位偏向于去極化，從而提高神經(jīng)細胞的興奮性^1-4。NALCN通道亞基在哺乳動物中高度保守，與電壓門控鈣離子通道（CaV）和電壓門控鈉離子通道（NaV）具有一定的同源性。NALCN的功能異常會導致多種嚴重的神經(jīng)疾病⁵，例如：患有精神運動發(fā)育遲緩和特征面相的小兒肌張力低下（IHPRF）^6,7、四肢和面部先天性攣縮、肌張力低下和發(fā)育遲緩（CLIFAHDD）⁸等。除此之外，也有報道顯示NALCN參與了呼吸節(jié)律¹、痛覺感知⁹、生物鐘¹⁰和快速動眼睡眠¹¹等重要的生物學過程。

盡管NALCN通道有著如此重要的功能，但其工作機制仍不清楚。有報道顯示在HEK293和爪蟾卵母細胞等異源體系中，只有共同表達NALCN、FAM155、UNC79和UNC80四個亞基，才能測量到典型的鈉漏電流²。其中，NALCN是孔道形成亞基^1,2；FAM155是跨膜調(diào)控亞基，協(xié)助NALCN上膜¹²；而UNC79和UNC80是分子量巨大（300 kD和370 kD）且功能尚不清楚的調(diào)控亞基^2,4。

2020年12月3日，北京大學未來技術(shù)學院分子醫(yī)學所陳雷研究組在Nature Communications雜志上報道了哺乳動物NALCN-FAM155A亞通道復合體的2.65?高分辨結(jié)構(gòu)。文章鏈接: (https://dx.doi.org/10.1038/s41467-020-20002-9)

本項研究使用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)來探究NALCN的工作機制。由于NALCN-FAM155-UNC79-UNC80四元復合體不夠穩(wěn)定，作者在此聚焦于較穩(wěn)定的NALCN-FAM155核心亞復合體的結(jié)構(gòu)解析。經(jīng)過同源蛋白篩選等步驟，作者確定以大鼠NALCN和小鼠FAM155A亞基組成的復合體為研究對象，并在克服了樣品制備、數(shù)據(jù)處理等困難后，通過單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了2.65?高分辨率的NALCN-FAM155A復合體的電子密度，并根據(jù)同源蛋白結(jié)構(gòu)搭建了原子模型。

結(jié)構(gòu)顯示NALCN整體結(jié)構(gòu)與CaV和NaV的結(jié)構(gòu)類似，由四個同源但不相同的重復結(jié)構(gòu)域（DI-DIV）組成，每個重復含有6個跨膜螺旋（S1-S6），其中位于中心的S5-S6形成了孔道區(qū)，而位于四周的S1-S4組成了電壓感受結(jié)構(gòu)域（VSD）。胞外FAM155A的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域（CRD）像蓋子一樣蓋在NALCN孔道結(jié)構(gòu)域的頂端，并與NALCN的胞外loop有著復雜而緊密的相互作用。此外，NALCN的C端結(jié)構(gòu)域（CTD）與III-IV螺旋（III-IVlinker）及DII-DIII間的CTD相互作用螺旋（CIH）共同組成了胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1. NALCN-FAM155A亞復合體的結(jié)構(gòu)

通過計算離子通過的路徑，作者發(fā)現(xiàn)NALCN胞外孔道區(qū)周圍的氨基酸帶有較多負電，利于吸引胞外鈉離子并排斥陰離子。而計算出的孔道半徑顯示孔道區(qū)在兩個地方收縮的很緊，一個是靠近胞內(nèi)的疏水的“門”，最小半徑小于1?，表明通道處于關(guān)閉狀態(tài)；另一個是靠近胞外的離子選擇過濾器，負責選擇性地通透鈉離子。序列比對的結(jié)果顯示NALCN的離子選擇過濾器由“EEKE”組成，不同于NaV的“DEKA”和CaV1.1的“EEEE”。高分辨率的電子密度顯示NALCN第四個結(jié)構(gòu)域的選擇過濾氨基酸E1389有兩種構(gòu)象，但均不位于選擇過濾器的高場強（HFS）層，從而導致在HFS層，NALCN與NaV的電荷分布相似，均為? ? + 0，這可能解釋了NALCN為何對鈉離子有更高的選擇性（圖2）。此外，有研究表明：相比于E1389，D1390對于胞外鈣離子阻塞NALCN的電流更加重要2，這也與所觀測到的結(jié)構(gòu)相吻合。

圖2. NALCN孔道區(qū)的結(jié)構(gòu)

NALCN通道復合體的電流也受到電壓調(diào)控，其中電壓感受結(jié)構(gòu)域VSD扮演著重要角色。VSD發(fā)揮功能依賴于其內(nèi)部的電荷轉(zhuǎn)移中心（CTC）和S4上連續(xù)的帶正電的氨基酸（R1-R6）。CTC主要由S2上一個芳香族氨基酸及間隔開的兩個帶負電的氨基酸（E1-F3-E4）和S3上相鄰的負電氨基酸組成。相比NaV和CaV等電壓門控離子通道，NALCN的VSD發(fā)生了不同程度的退化。根據(jù)序列比對和結(jié)構(gòu)比較，可以發(fā)現(xiàn)NALCN的VSD_I和VSD_II有著完整的CTC和S4上的正電氨基酸簇；而VSD_III的CTC并不完整，缺少S2上關(guān)鍵的芳香族氨基酸；VSD_IV雖然有著完整的CTC，但S4僅僅只有兩個帶正電的氨基酸（圖3）。先前的研究結(jié)果表明VSD_I和VSD_II的S4上的正電氨基酸對于NALCN的活性至關(guān)重要，而VSD_III和VSD_IV的S4上的正電氨基酸則可有可無²，這與所觀測到的結(jié)構(gòu)一致。

圖3. NALCN電壓感受結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)

綜上所述，本項研究通過結(jié)構(gòu)生物學技術(shù)，觀測到了哺乳動物NALCN-FAM155A亞復合體的高分辨結(jié)構(gòu)，為深入理解NALCN的鈉離子選擇性、胞外鈣離子阻塞和電壓調(diào)節(jié)特性等奠定了基礎。

在本項工作的撰寫和投稿過程中，美國基因泰克公司研究組和西湖大學研究組分別在2020的Nature¹³和Nature Communications¹⁴雜志上報道了人源的NALCN-FAM155A亞復合體2.8 ?和3.1 ?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。這些研究報道的結(jié)構(gòu)與本研究在整體上相似，但本研究依據(jù)高質(zhì)量的電子密度，發(fā)現(xiàn)了NALCN通道離子選擇過濾器的新構(gòu)象，并搭建了CTD互作螺旋（CIH）和更加完整的FAM155A的原子模型。

本項研究主要由北京大學未來技術(shù)學院分子醫(yī)學所博士生康云路完成，生命科學聯(lián)合中心博士后吳驚香參與了電鏡數(shù)據(jù)收集的工作，陳雷研究員為通訊作者。陳雷實驗室主要研究代謝類疾病和心血管疾病藥物靶點的工作機制，長期招收對此方向感興趣的博士生和博士后。本工作獲得生命科學聯(lián)合中心CLS、科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金委、青年千人計劃和膜生物國家重點實驗室的經(jīng)費支持。博士后吳驚香獲得了CLS博士后獎學金、北京大學博雅博士后獎學金、國家自然科學基金及中國博士后科學基金的支持。該工作的冷凍電鏡樣品制備、篩選和采集在北京大學冷凍電鏡平臺上完成，得到了李雪梅、郭振璽、邵博、裴霞和王國鵬等人的幫助。該項目的數(shù)據(jù)處理獲得了北京大學CLS計算平臺及未名超算平臺的硬件和技術(shù)支持。本項研究得益于賓夕法尼亞大學Dejian Ren教授贈送的大鼠和人源NALCN、小鼠UNC79和UNC80的cDNA，美國西北大學Lear Bridget教授提供的果蠅UNC79和UNC80的cDNA，美國西北大學Ravi Allada教授提供的果蠅NCA和NLF-1的cDNA，日本國立遺傳學研究所Yuji Kohara教授提供的線蟲NCA1的cDNA。

1 Lu, B. et al. The neuronal channel NALCN contributes resting sodium permeability and is required for normal respiratory rhythm. Cell129, 371-383, doi:10.1016/j.cell.2007.02.041 (2007).

2 Chua, H. C., Wulf, M., Weidling, C., Rasmussen, L. P. & Pless, S. A. The NALCN channel complex is voltage sensitive and directly modulated by extracellular calcium. Science Advances6, eaaz3154, doi:10.1126/sciadv.aaz3154 (2020).

3 Lu, B. et al. Peptide neurotransmitters activate a cation channel complex of NALCN and UNC-80. Nature457, 741-744, doi:10.1038/nature07579 (2009).

4 Lu, B. et al. Extracellular calcium controls background current and neuronal excitability via an UNC79-UNC80-NALCN cation channel complex. Neuron68, 488-499, doi:10.1016/j.neuron.2010.09.014 (2010).

5 Bramswig, N. C. et al. Genetic variants in components of the NALCN-UNC80-UNC79 ion channel complex cause a broad clinical phenotype (NALCN channelopathies). Human genetics137, 753-768, doi:10.1007/s00439-018-1929-5 (2018).

6 Al-Sayed, M. D. et al. Mutations in NALCN cause an autosomal-recessive syndrome with severe hypotonia, speech impairment, and cognitive delay. American journal of human genetics93, 721-726, doi:10.1016/j.ajhg.2013.08.001 (2013).

7 K?ro?lu, ?., Seven, M. & Tolun, A. Recessive truncating NALCN mutation in infantile neuroaxonal dystrophy with facial dysmorphism. Journal of medical genetics50, 515-520, doi:10.1136/jmedgenet-2013-101634 (2013).

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11 Funato, H. et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature539, 378-383, doi:10.1038/nature20142 (2016).

12 Xie, L. et al. NLF-1 delivers a sodium leak channel to regulate neuronal excitability and modulate rhythmic locomotion. Neuron77, 1069-1082, doi:10.1016/j.neuron.2013.01.018 (2013).

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來源：北京大學分子醫(yī)學研究所