2020年11月27日，清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心主任施一公教授研究組就剪接體的機(jī)理與結(jié)構(gòu)研究，于《科學(xué)》（Science）雜志以長(zhǎng)文形式再次發(fā)表重大研究成果（圖1）。這篇題為《ATP水解酶/解旋酶Prp2及其激活因子Spp2催化剪接體激活過程中結(jié)構(gòu)重塑的分子機(jī)理》（Mechanism of Spliceosome Remodeling by the ATPase/helicase Prp2 and its Coactivator Spp2）的論文報(bào)道了釀酒酵母處于激活狀態(tài)的剪接體（activated spliceosome，定義為“Bact復(fù)合物”）2.5埃的高分辨率電鏡結(jié)構(gòu)，此外還解析了ATP水解酶/解旋酶Prp2處于游離狀態(tài)以及Prp2與其激活因子Spp2復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是目前報(bào)道的最高分辨率的剪接體結(jié)構(gòu)，首次展示了剪接體狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中的“動(dòng)力驅(qū)動(dòng)”蛋白——ATP水解酶/解旋酶Prp2及其激活因子Spp2催化其重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并結(jié)合大量生化實(shí)驗(yàn)，闡明了Prp2在前體信使RNA上單向移動(dòng)的分子機(jī)理，回答了Spp2如何通過將Prp2錨定在剪接體上輔助其發(fā)揮重塑剪接體的功能等一系列重要科學(xué)問題。圖1 ?施一公研究組最新《科學(xué)》長(zhǎng)文1977年，科學(xué)家們首次發(fā)現(xiàn)來自于腺病毒的mRNA與其對(duì)應(yīng)的DNA轉(zhuǎn)錄模板并不能形成連續(xù)的雜交雙鏈，而是在雜交雙鏈的不同位置伸出了環(huán)狀的DNA單鏈。這個(gè)重大發(fā)現(xiàn)表明，遺傳信息從DNA傳遞到mRNA上并不只是通過轉(zhuǎn)錄，還需要pre-mRNA剪接來進(jìn)一步完成“無效”遺傳信息的去除與有效遺傳信息的拼接。不能被翻譯的“無效”RNA片段被稱為內(nèi)含子，而可以被核糖體翻譯的RNA片段叫做外顯子，內(nèi)含子被去除、外顯子被連接這一過程即為RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，隨著物種的進(jìn)化，含有內(nèi)含子的基因數(shù)量增加，發(fā)生RNA剪接的頻率也相應(yīng)增高，使得一個(gè)基因編碼多個(gè)蛋白質(zhì)成為可能，極大的豐富了蛋白質(zhì)組的多樣性，也是真核生物多樣性的重要原因之一。RNA剪接是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一，其化學(xué)本質(zhì)是兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。這種看似簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)在細(xì)胞中難以自行發(fā)生，而負(fù)責(zé)執(zhí)行這一化學(xué)反應(yīng)的是細(xì)胞核內(nèi)一個(gè)巨大且高度動(dòng)態(tài)變化的分子機(jī)器——剪接體（spliceosome）。從1977年首次發(fā)現(xiàn)RNA剪接至本世紀(jì)初，科學(xué)家們通過免疫沉淀、基因敲除、交聯(lián)質(zhì)譜、建立體外剪接反應(yīng)系統(tǒng)等研究手段，初步建立起剪接體的組裝、激活與解聚的發(fā)生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調(diào)控等復(fù)雜的RNA剪接調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在RNA剪接反應(yīng)過程中，多種蛋白-核酸復(fù)合物及剪接因子按照高度精確的順序發(fā)生結(jié)合、重排和解聚，依次形成預(yù)組裝復(fù)合物U4/U6.U5 tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復(fù)合物）以及至少10個(gè)狀態(tài)的剪接體E、A、pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS復(fù)合物。剪接體每種狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，都需要?jiǎng)恿︱?qū)動(dòng)蛋白——ATPase/helicase對(duì)剪接體的結(jié)構(gòu)重塑進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控（圖2），它們?cè)诖呋艚芋w構(gòu)象的改變、控制RNA剪接的進(jìn)程、對(duì)RNA進(jìn)行檢驗(yàn)和校對(duì)等過程中有著極其關(guān)鍵的作用，被譽(yù)為RNA剪接的“分子時(shí)鐘”。
圖2 ?RNA剪接示意圖（圖片來源:?Yan, C., Wan, R., & Shi, Y. (2019).
Cold Spring Harbor perspectives in biology, 11(1), a032409.）
由于剪接體高度的動(dòng)態(tài)性和復(fù)雜性，獲得不同狀態(tài)的剪接體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)被公認(rèn)為世界難題。在這種巨大的挑戰(zhàn)下，施一公教授率領(lǐng)研究組迎難而上，經(jīng)過7年的努力，終于在2015年在全世界首次報(bào)道了裂殖酵母剪接體3.6埃的高分辨率結(jié)構(gòu)，首次展示了剪接體催化中心近原子分辨率的結(jié)構(gòu)。這一重大研究成果對(duì)RNA剪接機(jī)理的研究產(chǎn)生革命性影響。自2015年第一個(gè)剪接體結(jié)構(gòu)發(fā)表以后，施一公研究組相繼解析了釀酒酵母剪接體復(fù)合物全部已被鑒定的9個(gè)不同狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)，分別是3.8埃的預(yù)組裝復(fù)合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.3埃-4.6埃的預(yù)催化剪接體前體pre-B complex、3.9埃的預(yù)催化剪接體B complex、3.5埃的激活狀態(tài)剪接體Bact complex、2.9埃-3.8埃的催化激活剪接體B* complex、3.4埃的第一步催化反應(yīng)后剪接體C complex、4.0埃的第二步催化激活剪接體C* complex、3.6埃的完成兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后的剪接體P complex，以及3.5埃的內(nèi)含子套索剪接體ILS complex的結(jié)構(gòu)。這些已解析的剪接體覆蓋了RNA剪接循環(huán)，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應(yīng)的工作機(jī)理，同時(shí)為理解剪接體的組裝、激活和解聚等過程的發(fā)生提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。然而，在每種狀態(tài)的剪接體結(jié)構(gòu)中，“動(dòng)力源”蛋白ATPase/helicase均處于剪接體的邊緣，它們的構(gòu)象極不穩(wěn)定，因此無法揭示“分子時(shí)鐘”精確的原子模型。如何闡述剪接體重塑蛋白控制剪接體狀態(tài)轉(zhuǎn)變的分子機(jī)理，一直是領(lǐng)域內(nèi)的核心難題之一。在最新發(fā)表的這篇《科學(xué)》文章中，施一公研究組以激活剪接體的結(jié)構(gòu)重塑蛋白Prp2為切入點(diǎn)，巧妙地設(shè)計(jì)了Prp2的突變體，使其失去結(jié)合ATP的功能，成功的將RNA剪接阻斷并富集了大量的激活狀態(tài)剪接體Bact complex；失活的Prp2也更加穩(wěn)定地結(jié)合在剪接體上，從而最終獲得了構(gòu)象穩(wěn)定、性質(zhì)良好的Bact complex樣品。隨后利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出了整體分辨率為2.5埃的Bact complex冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，其中，處于剪接體邊緣的結(jié)構(gòu)重塑蛋白ATPase/helicase Prp2與其激活因子Spp2的分辨率高達(dá)3.2埃，并搭建了原子模型（圖3）。
圖1 ?施一公研究組最新圖3 釀酒酵母激活剪接體及結(jié)構(gòu)重塑蛋白Prp2的三維結(jié)構(gòu)
《科學(xué)》長(zhǎng)文
在如此高的分辨率下，該文解析的Bact complex結(jié)構(gòu)首次觀察到了剪接體核心區(qū)域中的水分子通過氫鍵參與關(guān)鍵剪接位點(diǎn)的識(shí)別、以及與金屬離子的配位結(jié)合。令人驚喜的是，該結(jié)構(gòu)展示了激活因子Spp2通過四個(gè)關(guān)鍵的錨定位點(diǎn)，將Prp2固定到剪接體上。Spp2對(duì)于Prp2激活剪接體、催化剪接體結(jié)構(gòu)重塑的重要作用也被基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的大量生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本文另一亮點(diǎn)是通過分析Prp2結(jié)合前體信使RNA的相互作用界面，并結(jié)合體外剪接反應(yīng)等生化實(shí)驗(yàn)、以及所解析的3個(gè)不同狀態(tài)的Prp2電鏡結(jié)構(gòu)，第一次揭示了Prp2作為ATPase/helicase在單鏈RNA上單向移動(dòng)的分子機(jī)理。其中，兩個(gè)關(guān)鍵的氨基酸L536和R844在阻止RNA反向滑動(dòng)中起到了至關(guān)重要的作用，保證Prp2在前體信使RNA上由3’向5’方向移動(dòng)，從而將分支點(diǎn)區(qū)域的蛋白復(fù)合物從剪接體上解離下來，促使剪接體發(fā)生結(jié)構(gòu)重塑進(jìn)而發(fā)生第一步剪接反應(yīng)（圖4）。圖4 結(jié)構(gòu)重塑蛋白Prp2及其激活因子Spp2的三維結(jié)構(gòu)此前，施一公研究組解析了已被鑒定的酵母中全部狀態(tài)的剪接體高分辨三維結(jié)構(gòu)，而本文作為第一篇剪接體重塑機(jī)制的結(jié)構(gòu)研究，首次揭示了位于剪接體原位的ATPase/helicase高分辨率的三維結(jié)構(gòu)，為理解剪接體激活重塑的分子機(jī)理提供了迄今最清晰的結(jié)構(gòu)信息。施一公教授、萬蕊雪博士為本文的共同通訊作者；西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后白蕊、西湖學(xué)者萬蕊雪和清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心助理教授閆創(chuàng)業(yè)為該文的共同第一作者，清華大學(xué)生命學(xué)院博士生賈麒參與了部分生化實(shí)驗(yàn)；清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)主管雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)，計(jì)算工作得到清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)、國家蛋白質(zhì)設(shè)施實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心（北京）的支持。本工作獲得了西湖教育基金會(huì)、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心（清華）及國家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費(fèi)支持。
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