隨著合成生物學與基因編輯技術的發(fā)展，在科學研究中需要編輯越來越多的基因，例如，為了構建特定功能的菌株需要進行多輪的基因編輯，而且需要通過不同基因編輯的組合構建大量菌株進行“試錯”篩選。現(xiàn)有基因編輯方法需要引入特定篩選標記或特定抗性的質粒來完成基因編輯，這些篩選標記或者質粒需要在下一輪基因編輯前去除，從而實現(xiàn)無痕編輯或篩選標記的重復利用。然而，篩選標記或質粒的去除效率很難達到100%（即會發(fā)生逃逸），因此在去除標記后需要進行單克隆的篩選和確認。這增加了多輪基因編輯的周期，且需要更多的培養(yǎng)次數(shù)，增加了基因組自發(fā)突變的風險。

中國科學院青島生物能源與過程研究所研究員咸漠帶領的材料生物合成技術中心，基于“剪刀石頭布”策略實現(xiàn)免篩選標記/質粒消除步驟的多輪基因編輯方法，相關研究成果近日發(fā)表在Nucleic Acids Research上。研究構建了三個能夠循環(huán)消除的基因編輯輔助質粒（pRock，pPaper，pScissors），在按照“剪刀-石頭-布”順序分別使用這三個質粒實施基因編輯時，可同時去除上一輪基因編輯中使用的輔助質粒，從而免除了傳統(tǒng)方法中的篩選標記或質粒消除步驟，提高了多輪編輯的速度（圖1）。質粒消除效率可達到99.99-100%，幾乎不會有逃逸情況。另外，該系統(tǒng)還存在雙重檢查機制：如上一輪發(fā)生了逃逸的情況，由于質粒間的拮抗作用則不能進行下一輪編輯。該研究在大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌中對該方法進行了測試，快速完成了多輪的敲除、插入、替換等基因編輯操作。

利用本方法進行連續(xù)多輪基因編輯時，每一輪編輯僅需要進行兩次培養(yǎng)，即一次平板培養(yǎng)和一次單克隆液體培養(yǎng)（圖2），這幾乎是精細基因編輯所需要的最少培養(yǎng)次數(shù)。這不僅縮短了基因編輯周期，還減少了基因組隨機突變的可能性，這些優(yōu)勢在進行大規(guī)模多輪基因編輯時尤為明顯。該方法是目前最快最魯棒的多輪基因編輯策略，可與現(xiàn)有其他CRISPR/Cas9編輯優(yōu)化策略進行聯(lián)合使用，并且在未來更易于實現(xiàn)自動化，同樣策略也可用于其他物種的基因編輯。

青島能源所博士后王紀超、碩士研究生隋新悅為論文的共同第一作者，研究員趙廣、咸漠為論文共同通訊作者。研究工作得到國家自然科學基金委員會、國家國防科技工業(yè)局等的資助。

該研究相關質粒可從第三方開放獲?。篗olecularCloud（www.molecularcloud.org），MC_0101139、MC_0101140、MC_0101141，建議同時獲取MC_0000011及MC_0000012。

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　　圖1.基于“剪刀石頭布”策略的多基因編輯方法示意圖。A.三個能夠循環(huán)消除的基因編輯輔助質粒，在實施基因編輯的同時能消除上一輪的質粒。 B.相較于傳統(tǒng)方法，本方法不需要單獨的篩選標記或質粒消除步驟

圖2.基于“剪刀石頭布”策略的多輪基因編輯流程圖。A.“剪刀石頭布”基因編輯輔助質粒構建流程圖。B.連續(xù)多輪基因編輯步驟流程圖

來源： 青島生物能源與過程研究所