心血管疾病是威脅人類健康的主要?dú)⑹种?。?jù)統(tǒng)計(jì)，中國每年死亡總?cè)藬?shù)中約有40%是由于心腦血管疾病導(dǎo)致的，而心腦血管疾病的發(fā)生與膽固醇代謝異常密切相關(guān)。膽固醇是一種脂質(zhì)小分子，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組成成分，主要調(diào)控細(xì)胞膜的流動(dòng)性，也是膽酸、維生素D以及一些荷爾蒙合成的前體分子，同時(shí)還作為信號(hào)分子參與細(xì)胞內(nèi)多個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。當(dāng)人體內(nèi)膽固醇代謝異常，過量的膽固醇積累在血管中會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，最終可能引發(fā)冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病。

過去近30年，美國西南醫(yī)學(xué)中心的兩位諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Joseph Goldstein和Michael Brown領(lǐng)導(dǎo)的研究組通過一系列生化和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了膽固醇代謝的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制，即SREBP（Sterol Regulatory Element-Binding Protein）信號(hào)通路，來調(diào)控細(xì)胞水平的膽固醇攝取和合成，從而維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的穩(wěn)態(tài)。

盡管對(duì)于SREBP信號(hào)通路的細(xì)胞生物學(xué)與生物化學(xué)特征有了很多的研究，但受限于相關(guān)膜蛋白在表達(dá)純化結(jié)構(gòu)解析等方面的技術(shù)難度，這個(gè)領(lǐng)域的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)展一直很緩慢。這里面最關(guān)鍵的一個(gè)問題就是Scap和Insig蛋白的相互作用是如何被25HC等甾醇類分子調(diào)控的。

這道科學(xué)難題被顏寧教授戲稱為自己“初戀課題”：2001年她加入施一公教授在普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系的實(shí)驗(yàn)室讀博的第一個(gè)課題便是針對(duì)SREBP通路的結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物化學(xué)研究；2005年做博士后的第一個(gè)課題便是SREBP通路中的膜蛋白們；在清華獨(dú)立領(lǐng)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室之后的第一個(gè)科技部973項(xiàng)目也是針對(duì)SREBP通路的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。過去幾年，顏寧實(shí)驗(yàn)室先后解析了Insig的細(xì)菌同源蛋白MvINS的晶體結(jié)構(gòu)（2015）， Scap在裂殖酵母中的同源蛋白Scp1的C端結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（2015）及Scp1-Sre1復(fù)合物的低分辨電鏡結(jié)構(gòu)（2016）；為了理解SSD感受甾醇的機(jī)理，她的課題組系統(tǒng)研究了兩個(gè)含有SSD的蛋白NPC1（2016，2020）和Patched 1（2018, 2019）的工作機(jī)理。盡管這些前期成果很重要，但依然無法解釋Scap和Insig如何感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的膽固醇水平。要解答這個(gè)問題，必須獲得Scap-Insig結(jié)合25HC的高分辨率結(jié)構(gòu)。

顏寧課題組歷經(jīng)幾代博士生、博士后的努力，從獲得性質(zhì)穩(wěn)定、均一化程度較高的復(fù)合物到結(jié)構(gòu)解析，可謂是經(jīng)歷了“九九八十一難”。這個(gè)分子量小、結(jié)構(gòu)域靈活的膜蛋白復(fù)合物，即便到了冷凍電鏡時(shí)代，依舊是硬骨頭，很長一段時(shí)間，分辨率止步于五六埃，無法看到精細(xì)的結(jié)構(gòu)。為了解決這個(gè)難題，顏寧與專攻小分子膜蛋白電鏡結(jié)構(gòu)解析的清華大學(xué)生命學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖中心研究員閆創(chuàng)業(yè)博士合作，后者通過對(duì)算法的不斷創(chuàng)新和改進(jìn)，終于將跨膜區(qū)的分辨率提高到了4埃以內(nèi)！在獲得蛋白復(fù)合物的近原子分辨率結(jié)構(gòu)之后，研究組的成員們又通過大量生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段，與結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)相互印證，解釋了Scap和Insig蛋白依賴于25HC相互作用的一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理。

這篇文章主要報(bào)道了以下成果

2.?在Scap和Insig-2之間清晰看到了25HC分子，顛覆了之前對(duì)于25HC結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)控機(jī)理的認(rèn)知，并且解釋了為何多一個(gè)親水基團(tuán)的25HC比高度疏水的膽固醇更有效地促進(jìn)這兩個(gè)蛋白的相互作用；

3.?與其它含有SSD的如NPC1、Patched 1等蛋白相比，Scap的SSD有復(fù)雜的構(gòu)象變化：它的第四段跨膜螺旋S4從中間斷開，分成了S4a和S4b兩段，其中S4a向結(jié)構(gòu)域內(nèi)部彎折，從而提供了25HC結(jié)合所需要的空間，同時(shí)彎折區(qū)對(duì)于直接結(jié)合Insig以及兼容Scap上與Insig主要相互作用的S2新型構(gòu)象至關(guān)重要。生化實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)斷裂的跨膜區(qū)對(duì)于形成復(fù)合物的重要作用，從而解釋了為何兩個(gè)蛋白的相互作用需要25HC等甾醇分子，因?yàn)樵谑杷目缒^(qū)內(nèi)維持暴露親水基團(tuán)的斷裂螺旋結(jié)構(gòu)需要外界因素來穩(wěn)定，比如25HC的結(jié)合。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)分析，作者為此前的兩個(gè)經(jīng)典Scap突變，不需要25HC既可以結(jié)合Insig的D428A以及徹底喪失Insig結(jié)合能力的Y298C，提供了結(jié)構(gòu)解釋，并據(jù)此預(yù)測(cè)了Q432A可能會(huì)與D428A具有相似的效果，這一分析果然在生化實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。

顏寧、清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心閆創(chuàng)業(yè)為論文共同通訊作者，西湖大學(xué)博士后鄢仁鴻、清華大學(xué)博士生曹平平、宋聞麒為本文的共同第一作者。冷凍電鏡數(shù)據(jù)分別在國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)和西湖大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)收集，清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)和西湖大學(xué)超算中心分別為本研究的數(shù)據(jù)處理提供了支持。

2.?X. Gong et al., Structure of the WD40 domain of SCAP from fission yeast reveals the molecular basis for SREBP recognition. Cell Res 25, 401-411 (2015).

3.?X. Gong et al., Complex structure of the fission yeast SREBP-SCAP binding domains reveals an oligomeric organization. Cell Res 26, 1197-1211 (2016).

4.?X. Gong et al., Structural Insights into the Niemann-Pick C1 (NPC1)-Mediated?Cholesterol Transfer and Ebola Infection. Cell 165, 1467-1478 (2016).

5.?H. W. Qian et al., Structural Basis of Low-pH-Dependent Lysosomal Cholesterol Egress by NPC1 and NPC2. Cell 182, 98-111?(2020).

6.?X. Gong et al., Structural basis for the recognition of Sonic Hedgehog by human Patched1. Science 361, eaas8935 (2018).

7.?H. W. Qian et al., Inhibition of tetrameric Patched1 by Sonic Hedgehog through an asymmetric paradigm. Nat Commun 10, 2320 (2019).

來源：結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心