炎癥性皮膚?。↖nflammatory skin disorders，ISDs）是臨床當(dāng)中最為常見的一種頑疾，這些疾病大多是皮膚上皮屏障對(duì)過(guò)敏原和病原體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。

代表性疾病包括銀屑病、特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD），由此引發(fā)的全身或局部紅斑、多層銀白色鱗屑及不同程度的瘙癢，常常反復(fù)發(fā)作，經(jīng)久不愈，這不僅極大地影響了美觀，還會(huì)給患者的生理及心理帶來(lái)巨大的影響，讓人苦不堪言。

然而，當(dāng)下供患者選擇的獲批治療方案寥寥無(wú)幾。其中，外用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑是當(dāng)前的主流治療方式，如臨床常用的藥物地塞米松。但大多數(shù)患者在用藥后，治療效果往往難以達(dá)到預(yù)期，尤其是長(zhǎng)期使用極易產(chǎn)生耐藥問(wèn)題。

“我們一直在考慮，如何通過(guò)藥物制劑的手段來(lái)提高糖皮質(zhì)激素的敏感性，以有效改善糖皮質(zhì)激素的治療效果?！?浙江大學(xué)藥學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師平淵表示。

近日，平淵團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地提出了通過(guò)基因編輯的治療手段，并結(jié)合可溶性微針（microneedle，MN）技術(shù)，選擇性靶向敲除與耐藥相關(guān)的 NLRP3 基因，可顯著改善銀屑病及特應(yīng)性皮炎的治療效果。換句話說(shuō)，NLRP3 基因編輯和糖皮質(zhì)激素治療相結(jié)合（通過(guò) MN 介導(dǎo)的透皮給藥）有望成為治療 ISDs 的一種潛在有效策略。

該研究成果于 3 月 10 日發(fā)表在《科學(xué)進(jìn)展》（Science Advances）雜志上，標(biāo)題為《微針輔助基因編輯：一種通過(guò) CRISPR-Cas9 靶向 NLRP3 基因的透皮策略用于協(xié)同治療炎癥性皮膚疾病》（Microneedle-assisted genome editing: A transdermal strategy of targeting NLRP3 by CRISPR-Cas9 for synergistic therapy of inflammatory skin disorders）。

可溶性微針制備：膠原三肽、透明質(zhì)酸為基體材料

以往研究表明，NLRP3 炎癥小體（nod-like receptor family, pyrin domain–containing 3）激活后會(huì)增加免疫相關(guān)細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素的耐藥性。由于其存在皮膚的表皮及真皮層，這就意味著，目前研發(fā)靶向 NLRP3 炎癥小體的相關(guān)藥物很難透過(guò)皮膚吸收，抑制其活性，最終治療效果也時(shí)常不盡人意。

為了進(jìn)行有效給藥，平淵及其團(tuán)隊(duì)選擇了一種更加強(qiáng)效、直接的破局之路 —— 研發(fā)了專門用于治療 ISDs 可溶性微針貼片，可以直接透過(guò)皮膚角質(zhì)層等屏障，在表皮及真皮層降解釋放并遞送基因編輯藥物制劑，從而達(dá)到高效治療的目的。

圖 | 基因編輯蛋白（Cas9）和糖皮質(zhì)激素地塞米松（Dex）經(jīng)皮和細(xì)胞內(nèi)的分級(jí)遞送示意圖（來(lái)源：Science Advances）

“這項(xiàng)研究工作從開始到完成一共耗費(fèi)了約兩年的時(shí)間，前期的困難主集中于透皮制劑的制備與優(yōu)化，以及如何修復(fù)炎癥引起皮膚損傷組織?！?平淵說(shuō)道。

MN 貼片的設(shè)計(jì)包含三個(gè)組成部分：

（1）聚合物 / Cas9 核糖核蛋白（RNP）納米復(fù)合物，用于 Cas9 的胞內(nèi)遞送，靶向 NLRP3 炎性小體；

（2）地塞米松（Dex）負(fù)載的聚合物納米粒子，用于改善糖皮質(zhì)激素治療；

（3）含有 Cas9 納米復(fù)合物和 Dex 納米顆粒的可溶性 MN 貼片，用于經(jīng)皮共給藥。

具體而言，MN 貼片是通過(guò)微模塑的方法從生物相容性的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）和膠原三肽（collagen tripeptide，CTP）的水溶液中制備的。制備的 MN 陣列貼片的尺寸為 8 mm × 8 mm，15 × 15 的 MN 陣列。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，MN 為錐體，基底直徑為 200 μm，高度為 600 μm，形貌完整、均勻。

研究發(fā)現(xiàn)，CTP 濃度從 0 增加到 10% 時(shí)會(huì)對(duì) MN 的剛度產(chǎn)生影響。含 10% CTP 制成的 MN 貼片的機(jī)械強(qiáng)度為 1.5 N / 針，高于不含 CTP 的 MN 貼片（0.9 N / 針）。

此外，含 10% CTP 的 MN 貼片與含 20% CTP 的 MN 貼片在機(jī)械強(qiáng)度上沒(méi)有顯著差異。這樣制備出的 MN 貼片具有優(yōu)異的力學(xué)性能，擁有足夠的剛度確保皮膚的插入和滲透。然而當(dāng) CTP 含量從 10% 增加到 30% 時(shí)，MN 表面的粗糙度發(fā)生了明顯的變化。

因此，平淵團(tuán)隊(duì)選擇 HA 和 10% CTP 作為基體材料，制備出的 MN 貼片不僅具有良好的生物相容性，還能促進(jìn)膠原合成，減少經(jīng)皮水分流失，促進(jìn)皮膚病變的組織修復(fù)。因此，可溶性 MN 貼片可以極大地促進(jìn)這兩種納米制劑的透皮給藥。

可溶性微針可持續(xù)給藥，顯著改善炎癥表現(xiàn)

為了研究 MN 貼片在體內(nèi)的降解水平，平淵團(tuán)隊(duì)分別評(píng)估了羅丹明（rhodamine，一種紅色熒光染料）和標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC，一種綠色熒光染料）的基因編輯蛋白 Cas9 分別從從聚乳酸 – 羥基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）及 Cas9 載體中的釋放行為。

將 MN 貼片插入到小鼠皮膚后，發(fā)現(xiàn) MN 能迅速吸收皮膚中組織液并迅速溶解，同時(shí)能夠觀察到羅丹明和 Cas9-FITC 在表皮和真皮區(qū)域的分布情況。這些結(jié)果表明 Dex 和 Cas9 蛋白質(zhì)納米制劑在體內(nèi)的持續(xù)性釋放，證明 MN 貼片可以作為一個(gè)藥物儲(chǔ)庫(kù)，在皮膚內(nèi)能夠持續(xù)釋放治療藥物。

為了評(píng)估 MN 貼片對(duì)皮膚炎癥的治療作用，他們首先將 2,4 – 二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB）涂在裸露的背側(cè)皮膚上，造成典型的病變，如皮膚干燥、嚴(yán)重紅斑、出血、瘢痕、水腫、抓痕、糜爛等，從而建立 AD 小鼠模型，然后在局部連續(xù) 5 周涂敷 MN 貼片。

實(shí)驗(yàn)證明，負(fù)載 CP/Ad-SS-GD/ Cas9 或 PLGA/Dex 的 MN 貼片能夠適度緩解 AD 癥狀，其療效與市面使用的 Dex 乳膏或他克莫司軟膏相當(dāng)。而雙載 MN 貼劑（載有 RNP 和 DEX）的抗炎能力最強(qiáng)，小鼠皮膚的水腫、出血、紅斑、抓痕和侵蝕明顯減輕。

此外，在連續(xù)使用 MN 貼片治療 5 周后，可以觀察到小鼠背部的毛發(fā)再生。在治療期間，使用 MN 貼劑治療的小鼠沒(méi)有記錄到顯著的體重減輕，這表明在未來(lái)的臨床轉(zhuǎn)化中其具有較好的安全性。

瘙癢是 AD 的主要癥狀，夜間睡眠時(shí)，瘙癢會(huì)加劇，從而嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量。在 AD 模型小鼠中，后肢抓撓與瘙癢感相關(guān)，瘙癢緩解作為 AD 恢復(fù)的標(biāo)志，是判斷治療是否成功的關(guān)鍵指標(biāo)。與對(duì)照組相比，他們發(fā)現(xiàn)負(fù)載 Cas9 RNP 或 Dex 的 MN 貼片均能顯著減輕 AD 小鼠的抓撓行為。

正如預(yù)期的那樣，由于 NLRP3 基因破壞和糖皮質(zhì)激素治療的協(xié)同治療作用，雙載 MN 貼劑對(duì)瘙癢表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用。經(jīng)過(guò)臨床評(píng)分，發(fā)現(xiàn)采用雙載 MN 貼片治療后，小鼠皮炎的嚴(yán)重程度明顯降低，這說(shuō)明 MN 貼片在治療 AD 時(shí)的優(yōu)異性能。

“目前臨床常用的治療牛皮癬和特應(yīng)性皮炎的制劑為地塞米松乳膏及他克莫司軟膏。與這兩款制劑相比，我們的優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)微針技術(shù)高效通過(guò)皮膚的角質(zhì)層屏障。此外，可溶性微針含有膠原三肽，可以促進(jìn)皮膚損傷組織的與膠原合成，促進(jìn)皮損組織的修復(fù)。” 平淵指出。

談及此次研究的應(yīng)用場(chǎng)景與產(chǎn)業(yè)化趨勢(shì)，平淵表示，此次研發(fā)的微針貼皮未來(lái)可應(yīng)用于感染性皮膚病，如痤瘡、皮膚真菌病等；其他病原體感染相關(guān)皮膚病以及其他自身炎癥性皮膚病，比如自身免疫性表皮下蕁麻疹；皮膚因紫外光照射而老化的癥狀，以及皮膚醫(yī)美相關(guān)的場(chǎng)景。

并強(qiáng)調(diào)道，目前已有一些高新科技生物公司在對(duì)微針技術(shù)轉(zhuǎn)化及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)行了大量臨床前研究，他們相信這種技術(shù)在未來(lái)會(huì)有廣闊的前景和市場(chǎng)。

利用基因編輯手段，突破炎癥性皮膚病治療的核心難題

除了選用可溶性微針直接給藥之外，該研究另外一大巧妙之處就在于利用了第三代基因編輯 CRISPR/Cas9 技術(shù)，直接精準(zhǔn)敲除了 NLRP3 基因，有效降低了 NLRP3 炎癥小體的表達(dá)。

通過(guò)基于 CRISPR-Cas9 的基因編輯對(duì) NLRP3 炎癥小體的直接破壞，不僅可在 DNA 水平上抑制了 NLRP3 的激活，而且避免了如小分子抑制劑常見的脫靶效應(yīng)。

他們最近開發(fā)的聚合載體使 Cas9 RNP 能夠在細(xì)胞內(nèi)高效遞送，確保了 NLRP3 基因在皮下角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的高效基因組編輯。

同時(shí)，NLRP3 炎癥小體的破壞可以進(jìn)一步提高糖皮質(zhì)激素治療的敏感性。由于 Dex 在其入核過(guò)程中能夠誘導(dǎo)核孔擴(kuò)張，因此它在細(xì)胞內(nèi)的遞送將同時(shí)有助于基因組編輯劑的核進(jìn)入。

平淵告訴 DeepTech，其課題組一直致力于基因編輯遞送載體的研發(fā)及相關(guān)疾病的治療，也一直在探索是否可以利用基因編輯技術(shù)來(lái)解決炎癥性皮膚病的治療。同時(shí)，在浙江大學(xué)藥學(xué)院顧臻教授課題組微針貼片在透皮給藥制劑方面的工作，以及華南理工大學(xué)王均教授課題組在炎癥小體敲除后治療炎癥性疾病的啟發(fā)之下，他們最終決定嘗試?yán)谜n題組自己研發(fā)的基因編輯遞送載體，結(jié)合微針給藥技術(shù)，來(lái)治愈炎癥性皮膚病。

之所以選擇利用基因編輯手段進(jìn)行醫(yī)藥研究，與平淵個(gè)人的研究背景密切相關(guān)，更與研究團(tuán)隊(duì)成員的集體努力分不開關(guān)系。

圖 | 可溶性微針雙載貼片研究人員：左一平淵，中間萬(wàn)濤，右一潘齊（來(lái)源：受訪者）

平淵在新加坡攻讀博士期間主要從事基因遞送的載體研究，并關(guān)注非病毒載體在基因治療方面的應(yīng)用。但那時(shí)候基因治療方興未艾，并未有突破性的技術(shù)進(jìn)展。

直到 2012 年以 CRISPR/Cas9 為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)問(wèn)世，并迅速拓展至基因治療領(lǐng)域，彼時(shí)的他正在新加坡南洋理工大學(xué)從事博士后研究，當(dāng)時(shí)曾有意識(shí)地關(guān)注基因編輯領(lǐng)域的動(dòng)向。

2015 年被新加坡南洋理工大學(xué)聘為資深研究員，主要從事仿生蛋白作為藥物遞送載體的研究。直到 2017 年 10 月以浙江大學(xué) “百人計(jì)劃” 引進(jìn)人才的身份加盟浙江大學(xué)，并組建自己的研究小組，自此正式開始主攻基因編輯遞送技術(shù)及疾病治療。

而目前，他感興趣的領(lǐng)域是基因編輯非病毒載體，并在疾病與基因治療中的應(yīng)用。由于病毒病毒載體存在安全性和免疫原性的問(wèn)題，如最近有報(bào)道慢病毒載體在治療地中海貧血患者出現(xiàn)了嚴(yán)重的安全性問(wèn)題，如急性髓細(xì)胞白血病及骨髓增生異常綜合癥，所以他們將目光轉(zhuǎn)移到非病毒載體的研究，提高非病毒載體的安全性，并兼顧其有效性。

下一階段，他們希望通過(guò)研發(fā)出安全的非病毒基因載體，針對(duì)一些罕見病，如苯丙酮尿癥及酪氨酸血癥，展開治療研究。

來(lái)源：麻省理工科技評(píng)論