新型基因編輯系統(tǒng)引導(dǎo)編輯（prime editing，PE）可以在基因組的靶向位點實現(xiàn)任意類型的堿基替換、小片段的精準插入與刪除，這種靈活的、可設(shè)計的遺傳修飾能力使其在基礎(chǔ)研究、人類疾病治療和農(nóng)作物育種中潛力巨大。該系統(tǒng)由nCas9（H840A）融合逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）和pegRNA（prime editing guide RNA）組成，在pegRNA的引導(dǎo)下，nCas9切割非靶標鏈產(chǎn)生缺刻，釋放出可與其PBS序列結(jié)合的游離單鏈，從而起始逆轉(zhuǎn)錄酶對RT模板的逆轉(zhuǎn)錄過程，然后通過DNA修復(fù)將RT模板上對應(yīng)的堿基改變引入基因組。脫靶效應(yīng)是基因組編輯技術(shù)應(yīng)用轉(zhuǎn)化時需要解決的重要科學問題，然而引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在體內(nèi)是否存在全基因組范圍的脫靶尚未知，亟待全面、系統(tǒng)的評估。近日，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所研究員高彩霞研究組在植物細胞及個體兩個水平上對引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)進行了深入和系統(tǒng)的評估。

針對引導(dǎo)編輯pegRNA依賴型的脫靶效應(yīng)，研究設(shè)計了一系列在pegRNA的間隔序列（Spacer）與引物結(jié)合位點(PBS)序列不同位置上分別引入數(shù)量不同的錯配堿基，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)對間隔序列近PAM端或PBS的5’端的錯配的容忍程度較低。研究進一步對179個潛在的內(nèi)源脫靶位點的引導(dǎo)編輯情況進行高深度的檢測，發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在水稻內(nèi)源位點鮮有脫靶編輯。因此，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的pegRNA依賴型的脫靶效應(yīng)非常低，可通過pegRNA合理設(shè)計提升該系統(tǒng)的特異性。

高彩霞研究組前期研究表明，胞嘧啶堿基編輯器BE3可能造成不依賴于向?qū)NA全基因組水平的脫靶效應(yīng)（Jin et al.，Science，2019）。同時，由于水稻基因組小且再生植株具有相似的遺傳背景，可以克服動物全基因組重測序過程中大量的異質(zhì)細胞序列分析的復(fù)雜性難題。因此，研究重點評估了引導(dǎo)編輯系統(tǒng)是否造成不依賴pegRNA的全基因組范圍的脫靶效應(yīng)。通過對引導(dǎo)編輯水稻植株的全基因組測序分析，統(tǒng)計了全基因組范圍內(nèi)的堿基替換（single nucleotide variants，SNVs）和小片段插入與刪除突變（small insertions/deletions，Indels）數(shù)目，發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的表達不會在基因組內(nèi)引發(fā)額外的SNVs或Indels突變。研究還分析了外源過表達含有M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)是否會干擾細胞內(nèi)源的逆轉(zhuǎn)錄生物學過程。對水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子OsTos17和端粒區(qū)域的拷貝數(shù)及保真性分析顯示，引導(dǎo)編輯不影響逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性以及端粒酶的活性。此外，對高豐度mRNA及pegRNA序列的逆轉(zhuǎn)錄-插入的可能性也進行了分析，同樣發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)沒有在全基因組范圍內(nèi)產(chǎn)生pegRNA或mRNA序列的隨機插入。以上結(jié)果表明，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)不會造成全基因組范圍的不依賴于pegRNA的脫靶效應(yīng)。

綜上所述，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在全基因組范圍具有很高的編輯特異性。4月15日，相關(guān)研究成果在線發(fā)表在Nature Biotechnology（DOI:10.1038/s41587-021-00891-x）上。高彩霞研究組博士研究生靳帥、林秋鵬、朱子旭以，以及中科院微生物研究所博士駱迎峰為論文的共同第一作者，高彩霞為論文通訊作者。研究工作得到國家自然科學基金委員會、國家重點研發(fā)計劃、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項（A類）、中科院前沿科學重點研究計劃與中科院青年創(chuàng)新促進會的資助。

　　在植物細胞與個體兩個水平上對引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的特異性進行系統(tǒng)評價。a、水稻原生質(zhì)體水平分析179個脫靶位點處引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的pegRNA依賴型脫靶突變；b、植物個體水平全基因組測序分析引導(dǎo)編輯系統(tǒng)pegRNA不依賴型脫靶突變的實驗流程與設(shè)計；c、d，control、PE和BE3處理組在基因組內(nèi)的SNVs（c）與indels（d）數(shù)目。e、f，各處理組中含有端粒reads分布及數(shù)目比較；g、比較control與PE處理組中Cas9與HPT編碼區(qū)的reads所占T-DNA區(qū)域總reads的比例。

來源：中科院