不育癥在臨床上的發(fā)生率約為10%，其中單純與男性相關(guān)的因素約為30%，無精、少精、弱精及精子畸形等是導(dǎo)致男性不育的主要原因，且精子質(zhì)量逐年下降已經(jīng)成為一個世界范圍性的問題。

既往研究實(shí)驗(yàn)表明SLC22A14與男性的生育功能密切相關(guān)，然而其相關(guān)的生理機(jī)制卻并未得到很好的研究。近日，清華大學(xué)藥學(xué)院陳立功團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SLC22A14是一種核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過影響核黃素酶活性調(diào)控精子能量代謝，相關(guān)研究成果發(fā)表在Cell Reports上。

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主要研究成果
01
Slc22a14敲除后雄性小鼠出現(xiàn)不育現(xiàn)象
研究首先通過敲除Slc22a14構(gòu)建雄性小鼠不育模型，用于探究SLC22A14蛋白的生理功能。結(jié)果顯示Slc22a14敲除后，小鼠不能使雌性小鼠懷孕（圖1C），其精子鞭毛發(fā)生卷曲且呈現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)（圖D&F）。在體外試驗(yàn)中，Slc22a14敲除后的精子不能有效穿透卵細(xì)胞（圖1F&G），進(jìn)一步探究精子的頂體形成功能及精子移動能力（使精子有效穿透卵細(xì)胞的兩個關(guān)鍵能力），發(fā)現(xiàn)Slc22a14敲除后精子頂體功能正常（圖1J）而移動能力顯著受損（圖1K）。這些結(jié)果表明Slc22a14缺失后小鼠精子鞭毛發(fā)生卷曲，移動能力受損，導(dǎo)致雄性小鼠出現(xiàn)不育現(xiàn)象。
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圖1 Slc22a14敲除后小鼠表現(xiàn)出不育現(xiàn)象
02
代謝組學(xué)探究Slc22a14敲除小鼠精子的能量代謝改變機(jī)制
2.1 非靶向代謝組學(xué)

研究結(jié)果顯示Slc22a14敲除后，小鼠精子存活率并沒有發(fā)生顯著改變（圖2A），而其ATP含量顯著下降（圖2B），活性氧產(chǎn)生增加（圖2C），雖然其線粒體勢能降低，但其線粒體形態(tài)并未發(fā)生變化，這表明SLC22A14可能作用于精子能量代謝。對精子進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，差異代謝物pathway分析顯示Slc22a14敲除后精子糖酵解途徑表達(dá)上調(diào)（圖2E）而TCA循環(huán)顯著下調(diào)（圖2F）。研究進(jìn)一步通過13C示蹤實(shí)驗(yàn)對Slc22a14敲除后，精子糖酵解及TCA過程中的代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行了探究，證明Slc22a14敲除后精子的能量代謝發(fā)生改變，產(chǎn)能方式從氧化磷酸化途徑（OXPHOS）轉(zhuǎn)至糖酵解途徑。

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圖2 Slc22a14敲除后小鼠精子的能量代謝途徑發(fā)生改變
2.2 脂質(zhì)組學(xué)

非靶向代謝組學(xué)結(jié)果顯示Slc22a14敲除后，精子脂肪酸β氧化（FAO）受到抑制（圖2F），酰基肉堿的含量發(fā)生改變（圖3A&B），且在SLC22A14過表達(dá)的細(xì)胞中?；鈮A的含量顯著上升（圖3C），這表明脂肪酸代謝可能與SLC22A14的功能相關(guān)。進(jìn)一步脂質(zhì)組學(xué)分析顯示Slc22a14敲除后，精子游離脂肪酸（FFA）和甘油三酯（TAG）的含量都顯著上調(diào)（圖3D&E）。

體外培養(yǎng)試驗(yàn)顯示加入etomoxir（肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I，CPT1）及2-DG（己糖激酶抑制劑）后，精子ATP產(chǎn)量顯著降低（圖3F），顯示FAO與糖酵解過程共同作用于ATP產(chǎn)生。14C標(biāo)記試驗(yàn)顯示Slc22a14敲除后，F(xiàn)AO的終產(chǎn)物14CO2含量降低（圖3G），而14CO2在SLC22A14過表達(dá)細(xì)胞中顯著增多（圖3H）。OCR測試表明由etomoxir導(dǎo)致的OCR降低在野生型小鼠中更為顯著一些（圖3I&J）。這些結(jié)果說明Slc22a14敲除導(dǎo)致的ATP減少與FAO的阻滯有關(guān)。

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圖3 Slc22a14敲除后小鼠精子的脂質(zhì)代謝改變
03
SLC22A14功能探究
免疫熒光實(shí)驗(yàn)與精子不同部位的蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，SLC22A14位于精子的線粒體內(nèi)膜（IMM）上。進(jìn)一步線粒體的非靶向代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4個核黃素相關(guān)代謝物在SLC22A14過表達(dá)細(xì)胞株中顯著增多（圖4A），而核黃素在Slc22a14敲除細(xì)胞中顯著減少（圖4B）。同位素?cái)z入實(shí)驗(yàn)表明SLC22A14過表達(dá)后，核黃素含量增多（圖4C），3D模型及同位素實(shí)驗(yàn)顯示SLC22A14是一種具有高通量但低親和力的核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖4D-F）。

Slc22a14敲除后，精子中FAO相關(guān)的黃素酶活性降低，而通過核黃素缺乏的飲食喂養(yǎng)小鼠，發(fā)現(xiàn)該飲食結(jié)構(gòu)下小鼠精子表現(xiàn)出與Slc22a14敲除小鼠一致的表型，結(jié)合qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SLC22A14通過影響核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控精子能量代謝。

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圖4 SLC22A14是一種核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
小結(jié)
本研究結(jié)合現(xiàn)代化的組學(xué)工具與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對影響雄性生育功能的關(guān)鍵蛋白——SLC22A14的功能及其作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)SLC22A14是位于精子線粒體內(nèi)膜的核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其功能失調(diào)會干擾核黃素向線粒體中轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制黃素酶的數(shù)量和活性，從而影響到精子FAO及線粒體的氧化磷酸化過程，導(dǎo)致ATP減少最終引起雄性不育。