鏈霉菌是許多重要天然產(chǎn)物的生產(chǎn)者，其基因組蘊(yùn)含著大量未被開發(fā)的次級代謝生物合成基因簇。傳統(tǒng)的基于雙鏈斷裂的CRISPR/Cas9技術(shù)雖然已應(yīng)用于鏈霉菌的基因組編輯，但需提供外源修復(fù)模板，且在多位點同時編輯的應(yīng)用上仍有局限性。近年來，單堿基編輯技術(shù)已應(yīng)用于天藍(lán)色鏈霉菌等一些模式菌株中，相較于傳統(tǒng)CRISPR技術(shù)更為方便快捷。堿基編輯的效率與底盤菌株尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）的功能密切相關(guān)，前期研究多用枯草芽孢桿菌噬菌體來源的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制因子UGI來提升堿基編輯效率，但在某些情況下，其抑制效果并不理想。

　　中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員王猛帶領(lǐng)的高通量編輯與篩選平臺實驗室，與天津科技大學(xué)教授花而并團(tuán)隊合作，在模式菌株變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans?66中研究了UDG與堿基編輯效率的關(guān)系，開發(fā)出新一代堿基編輯器asRNA-BE（antisense RNA interference-enhanced CRISPR/Cas9 Base Editing method）?？蒲腥藛T利用融合了胞苷脫氨酶rAPOBEC1的BE系列堿基編輯器，實現(xiàn)基因組三個次級代謝基因的編輯。在此基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9輔助的基因敲除手段，分別構(gòu)建了尿嘧啶DNA糖苷酶UDG1和UDG2的單敲和雙敲菌株，發(fā)現(xiàn)在失活UDG1的情況下，堿基編輯效率可較原始提高3.4倍到67.4倍不等?？紤]到UDG是細(xì)胞修復(fù)過程中的關(guān)鍵酶，其長期缺失不利于菌株基因組的穩(wěn)定，科研人員利用反義RNA干擾降低基因表達(dá)水平的策略代替基因敲除，在原始的BE編輯器基礎(chǔ)上整合了針對UDG的反義RNA干擾模塊，構(gòu)建了新一代堿基編輯器asRNA-BE，將編輯效率提高至原來的2.8倍到65.8倍不等。asRNA-BE編輯器可以在堿基編輯過程中瞬時抑制UDG的表達(dá)，而在編輯結(jié)束后又可以通過溫敏型質(zhì)粒的消除恢復(fù)UDG的表達(dá)水平，在提高編輯效率的同時避免了對于細(xì)胞不可逆的傷害?；蚪M測序結(jié)果也表明，與BE編輯器相比，asRNA-BE編輯器在大幅度提高編輯效率的同時，并未引起額外的脫靶，在工業(yè)菌株改造等方面具有良好的應(yīng)用前景。

　　相關(guān)研究成果以封面文章形式發(fā)表在ACS Synthetic Biology上。天津工生所助理研究員張玥為論文第一作者。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動、國家自然科學(xué)基金等的支持。

　　論文鏈接

　　封面文章

　　asRNA-BE編輯器在變鉛青鏈霉菌中的應(yīng)用

來源： 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所