范可尼貧血癥（Fanconi anemia, FA）是一種嚴(yán)重的人類遺傳疾病，最初由瑞士?jī)嚎漆t(yī)生Guido Fanconi在1927年發(fā)現(xiàn)記錄(1)。其主要表現(xiàn)為骨髓衰竭（bone marrow failure，BMF）、發(fā)育畸形及癌癥的易發(fā)性。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)至少有22種FA基因（FANCA-W）的突變將會(huì)導(dǎo)致該疾病的發(fā)生。這些基因表達(dá)的蛋白共同參與一條特殊的DNA修復(fù)途徑——范可尼修復(fù)途徑（FA pathway）。由于FA患者的細(xì)胞對(duì)引發(fā)DNA鏈間交聯(lián)（interstrand crosslink， ICL）的藥物表現(xiàn)出超高的敏感性。因此，長(zhǎng)期以來(lái)人們普遍認(rèn)為FA途徑的主要功能是修復(fù)ICL，而FA疾病是由內(nèi)源性ICL的修復(fù)缺陷引起的。然而，產(chǎn)生ICL的內(nèi)源性誘導(dǎo)因素仍然難以捉摸。最近的小鼠和人類遺傳證據(jù)表明，內(nèi)源性的醛類是FA病癥的原因(2, 3)。但醛類不僅能夠引起ICLs，更多的是產(chǎn)生單加成物(4)、引起蛋白質(zhì)-DNA的交聯(lián)(5)，還能通過(guò)影響四氫葉酸的代謝產(chǎn)生復(fù)制壓力(6)。因此，依然無(wú)法確定哪種DNA損傷修復(fù)的缺陷最終導(dǎo)致FA疾病。

2021年6月10日，北京大學(xué)生命科學(xué)院、蛋白質(zhì)與植物基因研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室徐冬一課題組在Nature Structural & Molecular Biology上發(fā)表文章“Fanconi anemia proteins participate in a break-induced-replication-like pathway to counter replication stress”，發(fā)現(xiàn)FA途徑本質(zhì)上是一條斷裂誘導(dǎo)的復(fù)制（break-induced replication，BIR）途徑，用于修復(fù)停滯的復(fù)制叉，并且提出了持續(xù)復(fù)制壓力是FA癥狀的潛在內(nèi)源性病因的觀點(diǎn)。

染色體DNA在生命的延續(xù)過(guò)程中處于核心地位，因此DNA的精準(zhǔn)復(fù)制以及基因組的穩(wěn)定維護(hù)具有特別重大的意義。然而，來(lái)自于內(nèi)源以及外源的各種擾動(dòng)會(huì)干擾復(fù)制過(guò)程的正常進(jìn)行與完成，形成復(fù)制壓力（replication stress）。復(fù)制壓力會(huì)導(dǎo)致復(fù)制叉前進(jìn)減緩甚至停止，影響DNA的合成。持續(xù)的復(fù)制壓力會(huì)導(dǎo)致復(fù)制叉崩塌，從而造成雙鏈斷裂，該損傷對(duì)細(xì)胞以及生命體傷害巨大而且難以修復(fù)。復(fù)制壓力造成的復(fù)制叉停滯也是癌細(xì)胞基因組重排和突變的主要來(lái)源。因此損傷復(fù)制叉的修復(fù)和重啟對(duì)生命體具有重要的意義。

盡管FA蛋白已被證明可能參與復(fù)制壓力應(yīng)答，但與之相悖的是長(zhǎng)期以來(lái)人們從未發(fā)現(xiàn)FA缺失細(xì)胞對(duì)復(fù)制壓力藥物的敏感性(7-9)。該研究作者首先驗(yàn)證了這一結(jié)論，發(fā)現(xiàn)FA基因缺失型細(xì)胞對(duì)短期處理的復(fù)制壓力藥物aphidicolin（APH）或hydroxyurea（HU）并不敏感。令人驚訝的是，F(xiàn)A缺失細(xì)胞系對(duì)持續(xù)復(fù)制壓力藥物（APH或HU）處理表現(xiàn)出極高的敏感性。這種敏感性來(lái)自于持續(xù)復(fù)制壓力下，F(xiàn)A缺失細(xì)胞染色體的逐漸丟失。進(jìn)一步的免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FA細(xì)胞在分裂后期產(chǎn)生的超細(xì)DNA橋結(jié)構(gòu)（UFBs）以及微核均有明顯的增加。

該研究實(shí)驗(yàn)組在早期的研究(10)中發(fā)現(xiàn)，停滯的復(fù)制叉通過(guò)兩個(gè)主要途徑完成重啟過(guò)程：在復(fù)制壓力的早期依賴53BP1 的切割非依賴途徑，以及在復(fù)制壓力晚期依賴BRCA1 （也稱為FANCS，該基因突變也引起FA疾?。┑臄嗔颜T導(dǎo)復(fù)制（BIR）途徑。53BP1 和BRCA1 在復(fù)制壓力下拮抗性地調(diào)節(jié)了兩條停滯復(fù)制叉重啟途徑的選擇。BIR 是一種獨(dú)特的同源重組（homologous recombination，HR）機(jī)制，用于修復(fù)單端的DNA 斷裂。該途徑也參與分裂期DNA合成過(guò)程（Mitotic DNA Synthesis， MiDAS過(guò)程），它的缺失會(huì)導(dǎo)致UFB和微核。該研究作者證明了FA蛋白在BRCA1依賴的BIR/MiDAS途徑中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)A蛋白作用于BRCA1的下游、促進(jìn)復(fù)制叉切割，從而協(xié)助停滯的復(fù)制叉重新啟動(dòng)。在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)BIR途徑和FA途徑具有統(tǒng)一的分子機(jī)制：首先，53BP1-BRCA1拮抗性地調(diào)節(jié)FA途徑的起始步驟——復(fù)制叉切割，這種拮抗能力源自于它們?cè)趶?fù)制叉重啟中的功能；其次BIR途徑和FA途徑均是依賴核酸酶SLX4和FAN1來(lái)介導(dǎo)復(fù)制叉的切割過(guò)程；最后，它們均依賴于POLD3來(lái)完成DNA的合成過(guò)程。這表明FA途徑本質(zhì)上是一種BIR途徑。

FA蛋白參與復(fù)制重啟的模式圖

基于FA蛋白在復(fù)制壓力下的BIR途徑中的重要作用，本研究作者推測(cè)復(fù)制壓力可能是造成FA癥狀的內(nèi)源性因素。為了驗(yàn)證此猜想，本研究作者構(gòu)建了FANCL缺失的小鼠模型，通過(guò)每日腹腔注射低劑量的復(fù)制壓力藥物HU后，發(fā)現(xiàn)持續(xù)復(fù)制壓力能夠引發(fā)FANCL缺失小鼠的貧血癥狀，其小鼠造血祖細(xì)胞的增殖分化功能異常，最終觸發(fā)FANCL缺失小鼠的骨髓衰竭表型。在尋找FA病癥與復(fù)制壓力相關(guān)的生理?xiàng)l件下的證據(jù)時(shí)，本研究作者發(fā)現(xiàn)復(fù)制壓力能夠特異性誘導(dǎo)FANCC缺失的人淋巴TK6細(xì)胞7號(hào)染色體的丟失，這一現(xiàn)象與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的FA病人細(xì)胞頻發(fā)的7號(hào)染色體丟失相一致，進(jìn)一步說(shuō)明持續(xù)復(fù)制壓力是FA癥狀的潛在的內(nèi)源性病因。

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠股骨HE染色切片（a）和單位面積骨髓內(nèi)的細(xì)胞量統(tǒng)計(jì)（b）

該研究揭示了FA途徑本質(zhì)的功能和分子機(jī)制、闡釋了范可尼病癥發(fā)病的新機(jī)制。這不僅能夠幫助大家預(yù)防和治療FA基因突變導(dǎo)致的骨髓衰竭等癥狀，還將有助于正常人群預(yù)防和治療血液系統(tǒng)早衰，同時(shí)加深大家對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的理解，具有重要理論和臨床意義。

北京大學(xué)生命科學(xué)院徐冬一組許鑫璘博士、徐毅曦博士后為該研究論文的共同第一作者。此外，該組的郭瑞媛、續(xù)然和付聰聰?shù)韧瑢W(xué)也在該研究中作出了貢獻(xiàn)。同時(shí)該研究得到了北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李晴課題組、京都大學(xué)生命科學(xué)研究科放射生物學(xué)研究中心Minoru Takata課題組和京都大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科輻射遺傳學(xué)系Shunichi Takeda課題組的支持與幫助。

參考文獻(xiàn)：

1. Bogliolo M, Surrallés J. Fanconi anemia: a model disease for studies on human genetics and advanced therapeutics. Current opinion in genetics & development. 2015 2015/08/01/;33:32-40. doi:https://doi.org/10.1016/j.gde.2015.07.002.

2. Langevin F, Crossan GP, Rosado IV, Arends MJ, Patel KJ. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 2011 Jul 6;475(7354):53-8. eng. Epub 2011/07/08. doi:10.1038/nature10192. Cited in: Pubmed; PMID 21734703.

3. Hira A, Yabe H, Yoshida K, Okuno Y, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Miyano S, Nakamura J, Kojima S, Ogawa S, Matsuo K, Takata M, Yabe M. Variant ALDH2 is associated with accelerated progression of bone marrow failure in Japanese Fanconi anemia patients. Blood. 2013 2013/10/31/;122(18):3206-3209. doi:https://doi.org/10.1182/blood-2013-06-507962.

4. Duxin JP, Walter JC. What is the DNA repair defect underlying Fanconi anemia? Current Opinion in Cell Biology. 2015 2015/12/01/;37:49-60. doi:https://doi.org/10.1016/j.ceb.2015.09.002.

5. Cohen Hubal EA, Schlosser PM, Conolly RB, Kimbell JS. Comparison of Inhaled Formaldehyde Dosimetry Predictions with DNA–Protein Cross-Link Measurements in the Rat Nasal Passages. Toxicology and Applied Pharmacology. 1997 1997/03/01/;143(1):47-55. doi:https://doi.org/10.1006/taap.1996.8076.

6. Garcia-Calderon CB, Bejarano-Garcia JA, Tinoco-Gago I, Castro MJ, Moreno-Gordillo P, Piruat JI, Caballero-Velazquez T, Perez-Simon JA, Rosado IV. Genotoxicity of tetrahydrofolic acid to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Death Differ. 2018 Nov;25(11):1967-1979. Epub 2018/03/08. doi:10.1038/s41418-018-0089-4. Cited in: Pubmed; PMID 29511342.

7. Schlacher K, Wu H, Jasin M. A distinct replication fork protection pathway connects Fanconi anemia tumor suppressors to RAD51-BRCA1/2. Cancer cell. 2012 Jul 10;22(1):106-16. eng. Epub 2012/07/14. doi:10.1016/j.ccr.2012.05.015. Cited in: Pubmed; PMID 22789542.

8. Tian Y, Shen X, Wang R, Klages-Mundt NL, Lynn EJ, Martin SK, Ye Y, Gao M, Chen J, Schlacher K, Li L. Constitutive role of the Fanconi anemia D2 gene in the replication stress response. The Journal of biological chemistry. 2017 Dec 8;292(49):20184-20195. eng. Epub 2017/10/13. doi:10.1074/jbc.M117.814780. Cited in: Pubmed; PMID 29021208.

9. Chen X, Bosques L, Sung P, Kupfer GM. A novel role for non-ubiquitinated FANCD2 in response to hydroxyurea-induced DNA damage. Oncogene. 2016 Jan 7;35(1):22-34. eng. Epub 2015/04/22. doi:10.1038/onc.2015.68. Cited in: Pubmed; PMID 25893307.

10. Xu Y, Ning S, Wei Z, Xu R, Xu X, Xing M, Guo R, Xu D. 53BP1 and BRCA1 control pathway choice for stalled replication restart. eLife. 2017;6. doi:10.7554/eLife.30523.

來(lái)源：北京大學(xué)