2021年8月8日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心胡家志課題組在Nucleic Acids Research雜志在線發(fā)表題為“Global detection of DNA repair outcomes induced by CRISPR-Cas9”和“In-depth assessment of the PAM compatibility and editing activities of Cas9 variants”的兩篇研究論文。在這兩項(xiàng)研究中，研究人員先是“利其器”—開發(fā)了可以同時(shí)評(píng)估Cas9靶向點(diǎn)編輯產(chǎn)物及脫靶活性的新型生物信息工具PEM-Q。利用PEM-Q，研究人員在人和小鼠細(xì)胞中對(duì)Cas9編輯后的產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)且定量的評(píng)估，為基因編輯的特異性和安全性提供了重要啟示。之后研究人員利用PEM-seq/PEM-Q來“善其事”—對(duì)該領(lǐng)域內(nèi)目前常見的SpCas9變體的編輯活性，脫靶活性及對(duì)基因組不穩(wěn)定影響性進(jìn)行了全面的評(píng)估和脫靶預(yù)測(cè)，總結(jié)了這些變體在人類細(xì)胞中的編輯活性和脫靶活性，為在這些變體之間進(jìn)行選擇提供指導(dǎo)。

用于基因組編輯的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的發(fā)展改變了生命科學(xué)研究的方式，同時(shí)也為疾病的治療以及生物技術(shù)的發(fā)展帶來了巨大潛力。然而其脫靶活性一直制約著其在臨床治療上的進(jìn)一步應(yīng)用，同時(shí)在基因組編輯過程中產(chǎn)生的染色體異常結(jié)構(gòu)，包括染色體大片段缺失和易位也是目前臨床應(yīng)用的一大障礙，近期也引起了許多實(shí)驗(yàn)室的關(guān)注。作者首先在2019年發(fā)表的PEM-seq實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，利用其新開發(fā)的生物信息分析工具PEM-Q對(duì)Cas9編輯后的產(chǎn)物，副產(chǎn)物進(jìn)行了全面且定量的評(píng)估。PEM-Q檢測(cè)到大量有害的DNA修復(fù)產(chǎn)物，以小鼠CH12F3細(xì)胞中c-Myc位點(diǎn)為例，有近3%的大片段缺失（>100bp）、近1%的載體整合和近3%的染色體易位。同時(shí)作者進(jìn)一步探究了這些產(chǎn)物產(chǎn)生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)大片段缺失主要依賴于切割位點(diǎn)附近的微同源序列，載體整合則與載體的脆弱性相關(guān)，而脫靶或其他反復(fù)出現(xiàn)的DNA斷裂則主導(dǎo)了染色體易位。以上發(fā)現(xiàn)為基因組編輯的安全性提供了除脫靶效應(yīng)之外的另一個(gè)維度，為基因編輯工具的遞送方式提供指導(dǎo)。

圖1.PEM-Q全面揭示基因編輯產(chǎn)物規(guī)律。(A) PEM-Q檢測(cè)基因編輯產(chǎn)物類型；(B) 不同DNA修復(fù)蛋白缺失背景下，在CH12F3細(xì)胞c-Myc位點(diǎn)Cas9編輯時(shí)各產(chǎn)物的定量。

為了減少SpCas9的脫靶活性及拓寬其靶向范圍，該領(lǐng)域工作者開發(fā)出了多種SpCas9變體。作者進(jìn)一步利用PEM-seq/PEM-Q方法，對(duì)現(xiàn)今常用的8種SpCas9高保真變體（eSpCas9, FeCas9, HF1, Hypa, evo, HiFi, LZ3, Sniper ) 以及4種靶向范圍更廣泛的廣域編輯變體（xCas9, Cas9-NG, SpG, SpRY）的切割活性，脫靶情況和基因組不穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)且定量的評(píng)估。作者發(fā)現(xiàn)廣域編輯變體具有更加嚴(yán)重脫靶活性和切割自身表達(dá)載體的現(xiàn)象（圖2A，2C）。近乎無PAM序列限制的SpRY在靶向RAG1位點(diǎn)時(shí)，檢測(cè)到了188個(gè)脫靶位點(diǎn)，其脫靶活性讓人驚嘆。此外，作者使用了一套深度學(xué)習(xí)的模型來預(yù)測(cè)SpRY脫靶情況，發(fā)現(xiàn)在所有脫靶位點(diǎn)中前15個(gè)和67/80個(gè)預(yù)測(cè)的位點(diǎn)都是真正的脫靶位點(diǎn)（圖2B）。最后作者將SpRY與三個(gè)高保真SpCas9變體結(jié)合起來，產(chǎn)生了三個(gè)同時(shí)具有高保真和廣泛編輯范圍的新型變體（圖2D）。

圖2. 利用PEM-seq評(píng)估Cas9變體。(A) Cas9變體脫靶位點(diǎn)的數(shù)目；(B) 利用深度學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)SpRY的脫靶位點(diǎn)；(C) SpRY切割自身表達(dá)質(zhì)粒載體并造成大量外源片段插入基因組中；(D) SpRY與三個(gè)高保真SpCas9變體結(jié)合，降低脫靶活性。

總的來說，這兩篇文章的工作系統(tǒng)地評(píng)估了CRISPR-Cas9編輯過程中的DNA修復(fù)產(chǎn)物并闡述其影響機(jī)制，提示我們基因編輯時(shí)抑制非同源末端連接（NHEJ）的潛在誘變危險(xiǎn)。全面評(píng)估多種SpCas9變體的切割活性和特異性，促進(jìn)這些變體在合適的基因編輯背景下的應(yīng)用。同時(shí)，這兩項(xiàng)工作的研究結(jié)果提示Cas9的安全性評(píng)估不應(yīng)僅局限于脫靶效應(yīng)，靶位點(diǎn)大片段的刪除和染色體結(jié)構(gòu)變異也應(yīng)該得到重視。最后，研究結(jié)果提示染色體異常結(jié)構(gòu)不能通過使用SpCas9高保真變體來減弱，而以往通過抑制DNA損傷修復(fù)通路來增強(qiáng)同源重組效率的方式也并不可取。所以目前亟需尋找一種既可以保持基因編輯工具編輯活性又能有效降低脫靶活性和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變異的基因編輯工具。這樣，才能使基因編輯工具更廣泛、更安全地應(yīng)用于臨床。

北京大學(xué)胡家志研究員為兩篇文章的通訊作者。第一篇文章中，博士研究生劉孟竺、張微微、辛昌昌為共同第一作者。第二篇論文中，張微微為共同第一作者，尹健行為共同第一作者兼共同通訊作者。張丁崢嶸、尚雅芳、王渝鴻、艾晨、李嘉欣在這些工作中亦有重要貢獻(xiàn)。該研究還得到了上海生化所孟飛龍研究員的支持與合作。該研究得到了北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、科技部國(guó)家重大研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及生命科學(xué)學(xué)院儀器中心流式平臺(tái)的大力支持。

來源：北京大學(xué)