最近幾年的研究表明，染色體外環(huán)狀DNA（ecDNA）可以促進(jìn)癌基因擴(kuò)增，驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)化，并具有遺傳異質(zhì)性，在癌癥發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1,2,3,4]。但由于缺乏足夠的分子分析技術(shù)，盡管ecDNA自1964年以來就已為人所知，對(duì)其具體作用的闡明卻一直進(jìn)展緩慢。目前的研究主要通過拷貝數(shù)變異（如Amplicon Architect）[5]和識(shí)別ecDNA junction位點(diǎn)（如Circle-Map和CIRC_finder）[6,7]等方法從測(cè)序數(shù)據(jù)中識(shí)別ecDNA。但是對(duì)ecDNA功能表觀遺傳學(xué)的研究還很缺乏。而了解全基因組范圍ecDNA的染色質(zhì)狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)是至關(guān)重要的，有助于促進(jìn)對(duì)ecDNA及其在癌基因表達(dá)中的作用的深層認(rèn)識(shí)。用傳統(tǒng)的ATAC-Seq和Chip-Seq等方法進(jìn)行ecDNA研究時(shí)需要將DNA打斷，進(jìn)行短片段測(cè)序，配合的計(jì)算方法大部分是通過檢測(cè)junction位點(diǎn)來識(shí)別ecDNA，所以只能揭示鄰近junction區(qū)域的染色質(zhì)可及性和DNA結(jié)合蛋白修飾，而不能提供完整的ecDNA染色質(zhì)狀態(tài)以及中遠(yuǎn)端調(diào)控元件之間的關(guān)系。另外，傳統(tǒng)方法的數(shù)據(jù)分析基于peak calling策略，無法提供單分子級(jí)的ecDNA結(jié)構(gòu)和表觀遺傳信息，所以也無法獲得不同狀態(tài)下ecDNA分子的表觀異質(zhì)性。近兩年，基于單分子長讀長測(cè)序方法開發(fā)的nanoNOMe-seq[8]、SMAC-seq[9]和Fiber-seq[10]技術(shù)，可以同時(shí)獲得單個(gè)DNA分子的堿基信息和甲基化信息，已經(jīng)在單分子表觀遺傳異質(zhì)性與調(diào)控元件遠(yuǎn)端互作方面取得了應(yīng)用，但在ecDNA領(lǐng)域還未見報(bào)道。
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基于上述，華大基因唐沖博士團(tuán)隊(duì)于近日在表觀遺傳與染色質(zhì)研究權(quán)威期刊Epigenetics & Chromatin上發(fā)表題為”Sequencing of methylase-accessible regions in integral circular extrachromosomal DNA reveals differences in chromatin structure”的論文（點(diǎn)擊頁面左下方“閱讀原文”可查看），開發(fā)出一種單分子層級(jí)研究ecDNA染色質(zhì)開放性的新技術(shù) —— CCDA-seq。
01研究成果
該研究利用m6A MTase甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行處理，獲得單分子水平的染色質(zhì)開放性區(qū)域的m6A DNA甲基化修飾（(圖1A)。為了提高ecDNA捕獲效率，該方法還引入外切酶去除線性基因組DNA并通過納米孔測(cè)序?qū)ν暾膃cDNA進(jìn)行測(cè)序。對(duì)生成的數(shù)據(jù)，首先通過junction序列識(shí)別ecDNA分子，并動(dòng)態(tài)地將序列片段映射到基因組中（圖1B）?；趈unction的位置，重新組裝部分ecDNA序列作為新的參考，并根據(jù)重組后的ecDNA序列識(shí)別出m6A信號(hào)，以防止juction區(qū)域的信號(hào)產(chǎn)生偏差，并且重構(gòu)了完整的ecDNA（圖1B）。
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圖1 流程概況A. 左為ATAC-seq+ecDNA，右為CCDA-seq+ecDNA；B. 生信分析流程
為了提高m6A甲基化判讀的準(zhǔn)確性，該方法增加了陰性樣本進(jìn)行m6A甲基化的識(shí)別，通過高斯混合模型對(duì)calling的概率值分布進(jìn)行擬合，去除了背景噪聲（圖2）。并且通過與DNase-seq進(jìn)行比較，CCDA-seq與DNase-seq數(shù)據(jù)在高表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍顯示了相似的核小體模式，在不同分辨率的基因組尺度上也具有高度的一致性（圖3、圖4）。測(cè)序reads長度在10到100 kb之間，比傳統(tǒng)ATAC-seq中觀察到的Junction區(qū)域?qū)?0倍（圖5）。
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圖2 經(jīng)處理和未處理樣品的m6A甲基化概率分布A. 陰性樣本；B. 甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記樣本
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圖3 高表達(dá)基因在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍的染色質(zhì)可及性
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圖4 CCDA-seq信號(hào)與DNase-seq染色質(zhì)可達(dá)性信號(hào)在基因組上的分布
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圖5 ONT reads長度分布
進(jìn)一步，通過比較ecDNA和同源線性DNA的平均染色質(zhì)可及性，發(fā)現(xiàn)ecDNA染色質(zhì)的可及性大部分是高度開放的，并且比線性DNA的染色質(zhì)可及性更高，強(qiáng)化了ecDNA擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致更高的致癌基因轉(zhuǎn)錄的普遍觀點(diǎn)。（圖6）RNA-seq數(shù)據(jù)分析顯示，ecDNA高表達(dá)基因340個(gè)（25% rank），中表達(dá)基因464個(gè)（25-75% rank），低表達(dá)基因589個(gè)(75%-100% rank)，說明并不是所有的ecDNA基因都是高表達(dá)的（圖7）。通過分析轉(zhuǎn)錄起始/終止位點(diǎn)的附近的染色質(zhì)可及性信號(hào)，CCDA-seq準(zhǔn)確定位到NDR(nucleosome depletion regions)（圖8）。
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圖6 ecDNA和線性DNA中的甲基化率密度分布
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圖7 ecDNA和線性DNA上基因區(qū)域的平均甲基化率
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圖8 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)上下游ecDNA與線性DNA的信號(hào)值分布
為了進(jìn)一步探索ecDNA的功能，該方法對(duì)ecDNA單分子數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，重構(gòu)出完整ecDNA，并且ecDNA上攜帶完整的致癌基因。如TSG101?(Tumor Susceptibility Gene 101.)， 對(duì)ecDNA上的基因進(jìn)行Gene Ontology分析顯示富集到與癌癥顯著相關(guān)的通路，如GTPase activator activity。
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圖9 完整的ecDNA
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圖10 ecDNA相關(guān)基因的gene ontology分析
CCDA-seq 提供了單分子分辨率下數(shù)千堿基長度的染色質(zhì)狀態(tài)，通過比較ecDNA和線性基因組DNA中的單分子水平的染色質(zhì)信號(hào)分布，觀察到線性DNA和ecDNA中的多種染色質(zhì)可及性狀態(tài)，線性DNA (chr10: 4238321 – 42389251)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)采用兩種不同的構(gòu)象:一種是核小體不活動(dòng)狀態(tài)，另一種是由于極高的轉(zhuǎn)錄活性而基本缺乏核小體的狀態(tài)，而ecDNA中觀察到具有高度異質(zhì)性的核小體耗盡/占據(jù)模式，在bulk ATAC-seq中則無法獲得不同狀態(tài)下分子的表觀異質(zhì)性（圖11）。接下來，通過評(píng)估核小體定位相關(guān)性研究了ecDNA和線性基因組DNA的共可及性模式，與線性DNA相比，ecDNA中的核小體具有更高的相關(guān)性，并且ecDNA中的作用距離更遠(yuǎn)，表現(xiàn)出遠(yuǎn)程染色質(zhì)相互作用（圖12）。
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圖11 線性DNA與ecDNA單分子水平的染色質(zhì)信號(hào)分布A. 如圖所示是覆蓋線性DNA區(qū)域chr10: 4238321 – 42389201的所有reads。方框突出顯示了活性和非活性染色質(zhì)；B. 顯示的是覆蓋ecDNA區(qū)域chr10: 42383201 – 42389201的所有reads
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圖12 線性DNA與ecDNA的染色質(zhì)共可及性概況（chr16:46407201 – 46410201）
02總結(jié)
總體來說，利用CCDA-seq，觀察到了開放染色質(zhì)區(qū)域中ecDNA的多樣性，在數(shù)千堿基長度尺度上定位到了核小體的分布，以及量化了單分子分辨率下遠(yuǎn)端調(diào)控元件的染色質(zhì)狀態(tài)的相關(guān)性，揭示了單分子水平線性DNA與ecDNA不同的染色質(zhì)狀態(tài)。CCDA-seq有助于更全面地了解ecDNA表觀基因組的調(diào)控，為ecDNA調(diào)控的獨(dú)特機(jī)制提供深入的見解。
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