“RNA具有多種重要的生理功能，可在遺傳編碼、基因表達、基因調(diào)控和酶催化等過程發(fā)揮作用。RNA功能的發(fā)揮與其可折疊形成復雜的三維空間結構以及構象的動態(tài)變化密切相關，在結合配體(例如蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子等)或響應環(huán)境 (例如離子濃度、溫度、pH或機械力)變化時，RNA往往發(fā)生構象狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。研究表明，RNA的三維空間結構通常是在二級結構的基礎上，由共軸堆積、假結結構(pseudoknot)、A-小溝模體(A-minor motif)以及“吻式”發(fā)夾(kissing loop)等三級相互作用模體(tertiary interaction motifs)穩(wěn)定的。當前，人們對相關三級相互作用如何調(diào)控RNA的構象動態(tài)以實現(xiàn)RNA的多種生理功能的機制了解甚少。
黃病毒包括登革病毒、寨卡病毒和西尼羅河病毒等可在人群中引起感染，并導致一系列潛在的嚴重疾病。由于仍缺少有效的藥物和疫苗，黃病毒的傳播仍持續(xù)在全球形成健康威脅。黃病毒抗核酸外切酶RNA(xrRNA)是一類位于黃病毒基因組3’非翻譯區(qū)的RNA結構元件(圖1a)，可以折疊成獨特的環(huán)狀結構(圖1b)，并抵抗宿主5’→3’核糖核酸外切酶Xrn1的降解，導致宿主細胞中亞基因組RNA(sfRNA)的形成與積累，后者與病毒的致病性和免疫逃逸密切相關。研究表明，在黃病毒家族中，xrRNA的一級序列與高級結構都是高度保守的。在穩(wěn)定其環(huán)狀高級結構的三級相互作用模體中，存在兩個假結結構PK1和PK2，其中PK1的長度為2 bp，而PK2的長度從2-7 bp不等(圖1c)。黃病毒xrRNA的PK2長度變化的生理意義，包括對xrRNA的結構、構象動態(tài)以及抵抗Xrn1的降解功能的影響尚不清楚。
2021年11月5日，清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心方顯楊與陳春來課題組合作，在《自然通訊》 (Nature Communications)在線發(fā)表了題為“假結長度調(diào)控黃病毒xrRNA的折疊、構象動態(tài)與抗Xrn1酶切活性”(Pseudoknot length modulates the folding, conformational dynamics, and robustness of Xrn1 resistance of flaviviral xrRNAs)的研究論文。在該項研究中，方顯楊與陳春來課題組合作發(fā)展了基于非天然堿基系統(tǒng)的長鏈RNA位點特異性熒光探針標記方法，揭示了黃病毒xrRNA的PK2長度變化對其折疊、構象動態(tài)和抗酶切活性調(diào)控的分子機制，相關研究成果為應用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)技術開展長鏈RNA的構象動態(tài)與功能關系的研究以及拓展黃病毒xrRNA在生物醫(yī)學和生物材料中的潛在應用奠定了基礎。

smFRET技術是研究生物大分子構象動態(tài)的重要手段，其應用前提是實現(xiàn)生物大分子位點特異性的熒光探針標記 (圖2a)，而RNA特別是長鏈RNA的位點特異性熒光探針標記十分具有挑戰(zhàn)性。在該研究中，基于非天然堿基系統(tǒng)(NaM-TPT3) (圖2b)，研究者首先發(fā)展了長鏈RNA位點特異性熒光探針標記方法，通過重疊延伸PCR及體外轉(zhuǎn)錄, 分別向DNA模板和RNA轉(zhuǎn)錄本的特定位點引入非天然堿基對和炔基修飾的TPT3，進一步通過點擊化學反應將疊氮修飾的熒光探針與炔基修飾的RNA耦聯(lián)，從而實現(xiàn)對RNA的位點特異性熒光探針標記(圖2c-d)。該標記技術突破了傳統(tǒng)標記方法如化學合成等對RNA分子量的限制，可以高效、快速的實現(xiàn)對長鏈RNA位點特異性的熒光探針標記，將極大的推動smFRET技術在長鏈RNA構象動態(tài)研究中的應用。

清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心方顯楊與陳春來課題組合作報道長鏈RNA位點特異性熒光探針標記方法和黃病毒xrRNA構象動態(tài)與功能調(diào)控的分子機制-肽度TIMEDOO
圖1. 黃病毒xrRNA的PK2假結長度變化調(diào)控其構象動態(tài)和抗酶切活性的分子機制
接下來，研究者整合小角X射線散射(SAXS)、smFRET以及抗Xrn1酶切動力學實驗技術，研究了來自黃病毒家族的11種PK2長度不同(2-7 bp)的xrRNA在溶液中的折疊、構象動態(tài)及抗Xrn1酶切活性(圖1d-f)。SAXS和酶切實驗數(shù)據(jù)表明，xrRNA在溶液中的折疊(圖1d)和抗酶切活性(圖1e)均高度依賴于[Mg2+]，并且受到PK2長度的調(diào)控，PK2長度較長的xrRNA在較低的Mg2+濃度即可折疊為環(huán)狀高級結構并具備抵抗酶切的能力。smFRET實驗數(shù)據(jù)表明(圖1f)，xrRNA在溶液中是高度動態(tài)的，存在未折疊態(tài)、中間態(tài)及折疊態(tài)三種狀態(tài)，三種狀態(tài)的比例分布受到[Mg2+]及PK2長度的協(xié)同調(diào)控，其動力學遵循由未折疊態(tài)到中間態(tài)再到折疊態(tài)的折疊路徑。xrRNA在折疊態(tài)的比例與酶切降解速率之間的負相關性表明，xrRNA只有進入折疊態(tài)時才能抵抗酶切，并且受到解折疊動力學過程(由折疊態(tài)到中間態(tài)或未折疊態(tài))的控制，因而，xrRNA的結構、構象動態(tài)與其抗酶切功能密切相關。進一步的研究表明，在高[Mg2+]條件下，PK2較長的xrRNA可以緩解因三級相互作用模體如PK1或J2/3的突變而對其結構、動態(tài)特性和抗酶切活性的影響。綜合這些實驗結果，研究者們提出了黃病毒xrRNA在溶液中受Mg2+及PK2長度協(xié)同調(diào)控的折疊自由能面圖(圖1g)。這些研究成果揭示了黃病毒xrRNA的結構、構象動態(tài)與功能之間的高度相關性和由三級相互作用模體調(diào)控RNA構象動態(tài)與功能的新機制。
清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心方顯楊與陳春來課題組合作報道長鏈RNA位點特異性熒光探針標記方法和黃病毒xrRNA構象動態(tài)與功能調(diào)控的分子機制-肽度TIMEDOO
圖2. 基于非天然堿基系統(tǒng)的長鏈RNA位點特異性熒光探針標記方法
清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心方顯楊研究員與陳春來研究員為該論文的共同通訊作者。清華大學生命學院2016級博士畢業(yè)生牛曉林和2017級直博生孫瑞瑞為該論文共同第一作者。生命學院合作交流研究生陳志鳳、2017級直博生姚溢融參與了研究工作。美國阿貢國家實驗室左孝兵老師為SAXS數(shù)據(jù)的收集做出了重要貢獻。該研究受到國家自然科學基金委、北京市結構生物學高精尖創(chuàng)新中心、北京市生物結構前沿研究中心的經(jīng)費支持。
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https://doi.org/10.1038/s41467-021-26616-x
方顯楊與陳春來課題組聯(lián)合招聘博士后
方顯楊課題組主要開展非編碼RNA的整合結構生物學研究。課題組一方面整合運用小角X射線/中子散射技術、電子順磁共振/核磁共振技術、X射線晶體學、單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移、單分子納米孔技術以及計算模擬，研究RNA的結構、動態(tài)特性、相互作用與功能的關系；另一方面積極發(fā)展RNA的體外與活細胞內(nèi)位點特異性標記方法，發(fā)展體外與活細胞內(nèi)RNA三級結構研究的策略與實驗方案。

陳春來課題組主要包括構建和發(fā)展單分子熒光測量的新體系、新技術和新方法方面，以及利用單分子熒光技術闡釋重要生命過程的分子機制。具體成果包括發(fā)展突破單分熒光濃度壁壘的sm-PAFRET技術、高時空分辨率的scanning FRET-FCS技術和捕捉納米尺度相分離的dcFCCS技術。此外還利用單分子技術揭示了核糖體翻譯、AlkD蛋白搜尋靶點、Cas9和Cas12a搜索切割底物過程中的新現(xiàn)象和新機制。

歡迎感興趣的具有結構生物學或單分子生物物理學背景的研究人員申請相關課題組博士后或聯(lián)合博士后崗位。

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https://doi.org/10.1038/s41467-020-19260-4

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https://doi.org/10.1073/pnas.2005217117

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來源：清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心