“RNA具有多種重要的生理功能，可在遺傳編碼、基因表達(dá)、基因調(diào)控和酶催化等過程發(fā)揮作用。RNA功能的發(fā)揮與其可折疊形成復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)以及構(gòu)象的動態(tài)變化密切相關(guān)，在結(jié)合配體(例如蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子等)或響應(yīng)環(huán)境 (例如離子濃度、溫度、pH或機(jī)械力)變化時，RNA往往發(fā)生構(gòu)象狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。研究表明，RNA的三維空間結(jié)構(gòu)通常是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，由共軸堆積、假結(jié)結(jié)構(gòu)(pseudoknot)、A-小溝模體(A-minor motif)以及“吻式”發(fā)夾(kissing loop)等三級相互作用模體(tertiary interaction motifs)穩(wěn)定的。當(dāng)前，人們對相關(guān)三級相互作用如何調(diào)控RNA的構(gòu)象動態(tài)以實(shí)現(xiàn)RNA的多種生理功能的機(jī)制了解甚少。
黃病毒包括登革病毒、寨卡病毒和西尼羅河病毒等可在人群中引起感染，并導(dǎo)致一系列潛在的嚴(yán)重疾病。由于仍缺少有效的藥物和疫苗，黃病毒的傳播仍持續(xù)在全球形成健康威脅。黃病毒抗核酸外切酶RNA(xrRNA)是一類位于黃病毒基因組3’非翻譯區(qū)的RNA結(jié)構(gòu)元件(圖1a)，可以折疊成獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1b)，并抵抗宿主5’→3’核糖核酸外切酶Xrn1的降解，導(dǎo)致宿主細(xì)胞中亞基因組RNA(sfRNA)的形成與積累，后者與病毒的致病性和免疫逃逸密切相關(guān)。研究表明，在黃病毒家族中，xrRNA的一級序列與高級結(jié)構(gòu)都是高度保守的。在穩(wěn)定其環(huán)狀高級結(jié)構(gòu)的三級相互作用模體中，存在兩個假結(jié)結(jié)構(gòu)PK1和PK2，其中PK1的長度為2 bp，而PK2的長度從2-7 bp不等(圖1c)。黃病毒xrRNA的PK2長度變化的生理意義，包括對xrRNA的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象動態(tài)以及抵抗Xrn1的降解功能的影響尚不清楚。
2021年11月5日，清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心方顯楊與陳春來課題組合作，在《自然通訊》 (Nature Communications)在線發(fā)表了題為“假結(jié)長度調(diào)控黃病毒xrRNA的折疊、構(gòu)象動態(tài)與抗Xrn1酶切活性”(Pseudoknot length modulates the folding, conformational dynamics, and robustness of Xrn1 resistance of flaviviral xrRNAs)的研究論文。在該項(xiàng)研究中，方顯楊與陳春來課題組合作發(fā)展了基于非天然堿基系統(tǒng)的長鏈RNA位點(diǎn)特異性熒光探針標(biāo)記方法，揭示了黃病毒xrRNA的PK2長度變化對其折疊、構(gòu)象動態(tài)和抗酶切活性調(diào)控的分子機(jī)制，相關(guān)研究成果為應(yīng)用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)技術(shù)開展長鏈RNA的構(gòu)象動態(tài)與功能關(guān)系的研究以及拓展黃病毒xrRNA在生物醫(yī)學(xué)和生物材料中的潛在應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

smFRET技術(shù)是研究生物大分子構(gòu)象動態(tài)的重要手段，其應(yīng)用前提是實(shí)現(xiàn)生物大分子位點(diǎn)特異性的熒光探針標(biāo)記 (圖2a)，而RNA特別是長鏈RNA的位點(diǎn)特異性熒光探針標(biāo)記十分具有挑戰(zhàn)性。在該研究中，基于非天然堿基系統(tǒng)(NaM-TPT3) (圖2b)，研究者首先發(fā)展了長鏈RNA位點(diǎn)特異性熒光探針標(biāo)記方法，通過重疊延伸PCR及體外轉(zhuǎn)錄, 分別向DNA模板和RNA轉(zhuǎn)錄本的特定位點(diǎn)引入非天然堿基對和炔基修飾的TPT3，進(jìn)一步通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將疊氮修飾的熒光探針與炔基修飾的RNA耦聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)對RNA的位點(diǎn)特異性熒光探針標(biāo)記(圖2c-d)。該標(biāo)記技術(shù)突破了傳統(tǒng)標(biāo)記方法如化學(xué)合成等對RNA分子量的限制，可以高效、快速的實(shí)現(xiàn)對長鏈RNA位點(diǎn)特異性的熒光探針標(biāo)記，將極大的推動smFRET技術(shù)在長鏈RNA構(gòu)象動態(tài)研究中的應(yīng)用。

清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心方顯楊與陳春來課題組合作報(bào)道長鏈RNA位點(diǎn)特異性熒光探針標(biāo)記方法和黃病毒xrRNA構(gòu)象動態(tài)與功能調(diào)控的分子機(jī)制-肽度TIMEDOO
圖1. 黃病毒xrRNA的PK2假結(jié)長度變化調(diào)控其構(gòu)象動態(tài)和抗酶切活性的分子機(jī)制
接下來，研究者整合小角X射線散射(SAXS)、smFRET以及抗Xrn1酶切動力學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究了來自黃病毒家族的11種PK2長度不同(2-7 bp)的xrRNA在溶液中的折疊、構(gòu)象動態(tài)及抗Xrn1酶切活性(圖1d-f)。SAXS和酶切實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，xrRNA在溶液中的折疊(圖1d)和抗酶切活性(圖1e)均高度依賴于[Mg2+]，并且受到PK2長度的調(diào)控，PK2長度較長的xrRNA在較低的Mg2+濃度即可折疊為環(huán)狀高級結(jié)構(gòu)并具備抵抗酶切的能力。smFRET實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明(圖1f)，xrRNA在溶液中是高度動態(tài)的，存在未折疊態(tài)、中間態(tài)及折疊態(tài)三種狀態(tài)，三種狀態(tài)的比例分布受到[Mg2+]及PK2長度的協(xié)同調(diào)控，其動力學(xué)遵循由未折疊態(tài)到中間態(tài)再到折疊態(tài)的折疊路徑。xrRNA在折疊態(tài)的比例與酶切降解速率之間的負(fù)相關(guān)性表明，xrRNA只有進(jìn)入折疊態(tài)時才能抵抗酶切，并且受到解折疊動力學(xué)過程(由折疊態(tài)到中間態(tài)或未折疊態(tài))的控制，因而，xrRNA的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象動態(tài)與其抗酶切功能密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，在高[Mg2+]條件下，PK2較長的xrRNA可以緩解因三級相互作用模體如PK1或J2/3的突變而對其結(jié)構(gòu)、動態(tài)特性和抗酶切活性的影響。綜合這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者們提出了黃病毒xrRNA在溶液中受Mg2+及PK2長度協(xié)同調(diào)控的折疊自由能面圖(圖1g)。這些研究成果揭示了黃病毒xrRNA的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象動態(tài)與功能之間的高度相關(guān)性和由三級相互作用模體調(diào)控RNA構(gòu)象動態(tài)與功能的新機(jī)制。
清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心方顯楊與陳春來課題組合作報(bào)道長鏈RNA位點(diǎn)特異性熒光探針標(biāo)記方法和黃病毒xrRNA構(gòu)象動態(tài)與功能調(diào)控的分子機(jī)制-肽度TIMEDOO
圖2. 基于非天然堿基系統(tǒng)的長鏈RNA位點(diǎn)特異性熒光探針標(biāo)記方法
清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心方顯楊研究員與陳春來研究員為該論文的共同通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2016級博士畢業(yè)生牛曉林和2017級直博生孫瑞瑞為該論文共同第一作者。生命學(xué)院合作交流研究生陳志鳳、2017級直博生姚溢融參與了研究工作。美國阿貢國家實(shí)驗(yàn)室左孝兵老師為SAXS數(shù)據(jù)的收集做出了重要貢獻(xiàn)。該研究受到國家自然科學(xué)基金委、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心的經(jīng)費(fèi)支持。
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原文鏈接
https://doi.org/10.1038/s41467-021-26616-x
方顯楊與陳春來課題組聯(lián)合招聘博士后
方顯楊課題組主要開展非編碼RNA的整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。課題組一方面整合運(yùn)用小角X射線/中子散射技術(shù)、電子順磁共振/核磁共振技術(shù)、X射線晶體學(xué)、單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移、單分子納米孔技術(shù)以及計(jì)算模擬，研究RNA的結(jié)構(gòu)、動態(tài)特性、相互作用與功能的關(guān)系；另一方面積極發(fā)展RNA的體外與活細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性標(biāo)記方法，發(fā)展體外與活細(xì)胞內(nèi)RNA三級結(jié)構(gòu)研究的策略與實(shí)驗(yàn)方案。

陳春來課題組主要包括構(gòu)建和發(fā)展單分子熒光測量的新體系、新技術(shù)和新方法方面，以及利用單分子熒光技術(shù)闡釋重要生命過程的分子機(jī)制。具體成果包括發(fā)展突破單分熒光濃度壁壘的sm-PAFRET技術(shù)、高時空分辨率的scanning FRET-FCS技術(shù)和捕捉納米尺度相分離的dcFCCS技術(shù)。此外還利用單分子技術(shù)揭示了核糖體翻譯、AlkD蛋白搜尋靶點(diǎn)、Cas9和Cas12a搜索切割底物過程中的新現(xiàn)象和新機(jī)制。

歡迎感興趣的具有結(jié)構(gòu)生物學(xué)或單分子生物物理學(xué)背景的研究人員申請相關(guān)課題組博士后或聯(lián)合博士后崗位。

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相關(guān)論文鏈接
https://doi.org/10.1038/s41467-020-19260-4

https://doi.org/10.1039/d0sc01717e

https://doi.org/10.1073/pnas.2005217117

https://doi.org/10.1039/D1SC02633J

https://doi.org/10.1073/pnas.2002971117

來源：清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心