人類歷史上，大麻已被馴化并使用了數(shù)千年。完成于漢代的中國最古老的藥書《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“麻蕡（即大麻果實），味辛平。主五勞七傷，利五臟，下血，寒氣。多食，令人見鬼，狂走。久服，通神明，輕身”，這不僅介紹了大麻的藥學功效，還描述了人攝入大麻所引發(fā)的幻覺等精神活動的變化?，F(xiàn)在人們已經(jīng)知道，古書上所記載的大麻對人精神活動的影響是由其天然成分大麻素類分子進入人體后作用在內(nèi)源大麻素系統(tǒng)而實現(xiàn)的。

圖一：大麻形態(tài)示意

內(nèi)源大麻素（endocannabinoids, eCBs），包括花生四烯酸甘油酯（2-Arachidonoylgylcerol，簡稱2-AG）和花生四烯酸乙醇胺（N-arachidonoylethanolamide，簡稱AEA），是由神經(jīng)元合成和釋放的一類脂類神經(jīng)調(diào)質(zhì)分子。經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前末梢釋放，激活突觸后膜受體；而eCB“反其道而行之”——在突觸后神經(jīng)元釋放，逆行性地作用在特定類型神經(jīng)元突觸前膜大麻素受體CB1R（Cannabinoid receptor type 1）上，發(fā)揮突觸前抑制作用。近20年來的研究發(fā)現(xiàn)，eCB參與大腦多個腦區(qū)，包括皮層、海馬、紋狀體、杏仁核、下丘腦和黑質(zhì)等的突觸可塑性調(diào)節(jié)，對維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要，與獎賞行為、能量代謝、學習記憶、睡眠覺醒、情緒等多種生理過程密切相關(guān)。內(nèi)源大麻素系統(tǒng)的調(diào)控異常也與神經(jīng)退行性疾病、癲癇、成癮、抑郁癥和精神分裂癥等諸多神經(jīng)疾病和精神類疾病密切相關(guān)。然而，目前缺乏高靈敏度、高時空分辨率的實驗手段直接檢測在體eCB的動態(tài)變化，極大地限制了人們對其在生理和病理狀態(tài)下重要功能和分子調(diào)控機理的研究。

2021年11月11日，北京大學李毓龍教授實驗室在Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了題為“A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved imaging of endocannabinoid dynamics in vivo”的研究論文，報道了新型基因編碼的內(nèi)源大麻素探針GRABeCB2.0的開發(fā)和在體內(nèi)外多種場景下的應(yīng)用。李毓龍實驗室自2018年以來，先后開發(fā)了針對乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、腺苷、五羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)的熒光探針，此次發(fā)表的GRABeCB2.0是其又一力作，進一步擴展了GRAB系列熒光探針家族。

論文截圖

在這一工作中，李毓龍實驗室運用其先前設(shè)計的GRAB探針策略(GPCRactivation-based sensor)，基于人源大麻素受體CB1R和循環(huán)重排的綠色熒光蛋白cpEGFP開發(fā)了eCB探針eCB2.0。在體外培養(yǎng)的HEK293T細胞和原代神經(jīng)元中，eCB2.0探針均表現(xiàn)出良好的細胞膜定位，對外源加入的大麻素AEA和2-AG有亞微摩至微摩級的親和度，秒級的動力學響應(yīng)和高度的分子特異性（圖二）。此外，eCB2.0探針不會激活GPCR下游信號通路，表明探針本身對細胞的正常生理活動沒有明顯影響。

圖二：eCB2.0在HEK293T細胞和原代神經(jīng)元上的表現(xiàn)

那么，eCB2.0能否用來檢測神經(jīng)元釋放的eCB？作者先從體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元入手，證明eCB2.0能夠檢測到電刺激引發(fā)的來自神經(jīng)元的eCB釋放。通過藥理學方法，作者發(fā)現(xiàn)此時神經(jīng)元釋放的eCB類型主要為2-AG。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，即使不給予電刺激，也能記錄到離散分布的直徑約為10微米的自發(fā)性eCB2.0信號，表明eCB的釋放具有特異和局部的特性。在急性腦片這一更接近生理條件的體系中，電刺激和高鉀溶液刺激均能引起eCB的釋放，其局部釋放的特點也再次被驗證：eCB2.0能夠以單個軸突扣結(jié)（bouton），即單個突觸的空間分辨率，檢測到海馬體CB1R陽性神經(jīng)元上的eCB信號（圖三）。

圖三：急性海馬體腦片上由高鉀溶液刺激引發(fā)及自發(fā)的內(nèi)源大麻素信號具有單個突觸的分辨率

基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala, BLA）是介導恐懼反應(yīng)和加工厭惡記憶的關(guān)鍵腦區(qū)。內(nèi)源大麻素受體CB1R在此處有高水平的表達。為了研究活體動物在受到傷害刺激時BLA腦區(qū)處的eCB動態(tài)變化，作者借助AAV病毒在小鼠BLA表達eCB2.0探針并使用光纖記錄的手段成功檢測到給予小鼠足部電擊時的BLA腦區(qū)中eCB的信號。另一方面，在海馬體CA1腦區(qū)，作者使用活體雙光子雙色顯微成像的方式，記錄了小鼠跑步時CA1區(qū)神經(jīng)元的鈣信號和eCB信號，發(fā)現(xiàn)跑步行為總是伴隨著CA1神經(jīng)元的興奮以及eCB信號的上升，表明eCB2.0探針能夠?qū)崟r檢測小鼠在生理條件下（運動過程中）大腦中內(nèi)源大麻素的動態(tài)變化（圖四）。

圖四：小鼠受到足部電擊時BLA腦區(qū)的內(nèi)源大麻素信號和小鼠跑步時海馬體CA1腦區(qū)的內(nèi)源大麻素信號

當大腦處于疾病狀態(tài)時，eCB的釋放又會呈現(xiàn)什么樣的變化呢？過去的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源大麻素系統(tǒng)受損的動物易發(fā)癲癇。為了探究癲癇和eCB信號的聯(lián)系，作者構(gòu)建了癲癇模型小鼠，并借助雙光子成像記錄了小鼠癲癇發(fā)作時的神經(jīng)元活動和eCB動態(tài)。有意思的是，當小鼠被誘導發(fā)生癲癇時，海馬體CA1區(qū)神經(jīng)元表現(xiàn)出劇烈的鈣信號活動并伴隨強烈的eCB信號上升；更有意思的是，緊隨著癲癇發(fā)作后，作者在CA1腦區(qū)記錄到了沿著水平方向傳遞的強烈的“鈣波”信號和“eCB波”信號（見視頻截圖）。

視頻截圖：小鼠癲癇發(fā)作前后的海馬體CA1腦區(qū)的內(nèi)源大麻素信號和鈣信號的變化，注意內(nèi)源大麻素波和鈣波的傳遞

總而言之，在這項工作中，作者首次實現(xiàn)了對eCB的高時空間分辨率記錄，為科學界深入研究內(nèi)源大麻素在生理和病理條件下的重要功能和調(diào)控機理提供了有力的新工具。

值得一提的是，這項研究的合作者美國斯坦福大學Ivan Soltesz實驗室借助eCB2.0探針就內(nèi)源大麻素在大腦中的動態(tài)及其在癲癇中的作用進行了更進一步的研究，相關(guān)成果同期發(fā)表在Neuron雜志上（Farrell et al, 2021）。

圖五：Ivan Soltesz實驗室借助eCB2.0探針解析了活體動物海馬體內(nèi)源大麻素信號的分子特性和時空動態(tài)。他們發(fā)現(xiàn)，相較于正常生理活動時，癲癇引起大量2-AG的釋放，而2-AG為長時程的中風樣癥狀提供了基礎(chǔ)底物（Farrell et al, 2021）。

北大-清華生命科學聯(lián)合中心2021屆博士畢業(yè)生董傲為本文第一作者，李毓龍為通訊作者。清華大學本科畢業(yè)生何凱凱、北京大學博士研究生蔡儒儀、王歡、本科畢業(yè)生段佳麗等對文章作出了重要貢獻。該工作得到了美國國立衛(wèi)生研究院David Lovinger實驗室、美國冷泉港實驗室Bo Li實驗室、美國斯坦福大學Jun Ding實驗室和Ivan Soltesz實驗室等團隊的合作，并得到北京大學膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、國家自然科學基金、北京市科委及美國NIH腦計劃等機構(gòu)和經(jīng)費的大力支持。

來源：北京大學