中科院團隊提出低溫醫(yī)學新方法，首次實現(xiàn)干細胞-269℃液氦低溫保存，此前相關(guān)設(shè)備已在100多家醫(yī)院實現(xiàn)臨床應(yīng)用
深凍 -16℃、被冰封 4 個月，木蛙仍能復(fù)活。在被冷凍之前，木蛙會在組織中積累血漿尿素，一旦開始凍結(jié)，尿素可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖充當?shù)蜏乇Ｗo劑。
南極線蟲，作為已知唯一能在胞內(nèi)大面積冷凍中存活的動物，它產(chǎn)生的冰活性蛋白可作為再結(jié)晶的抑制劑，借此在細胞凍結(jié)過程中有效地控制冰晶生長行為。
這兩種動物的耐寒能力，給中科院低溫工程學重點實驗室副主任饒偉研究員帶來了研究靈感。
圖 | 饒偉（來源：饒偉）
日前，她和團隊在 Trends in Biotechnology 發(fā)表了題為 《用于先進冷凍保存的仿生材料和技術(shù)》（Bioinspired materials and technology for advanced cryopreservation ）的論文[1]。
圖 | 相關(guān)論文（來源：Trends in Biotechnology）
論文中，她就三維體相生物系統(tǒng)的仿生型低溫保存材料與技術(shù)的發(fā)展做以總結(jié)，并展望了低溫保存的未來發(fā)展趨勢。
低溫保存曾讓三萬年前的種子“復(fù)活”
根據(jù) Arrhenius 方程（阿倫尼烏斯公式， 化學反應(yīng)速率常數(shù)隨溫度變化關(guān)系的經(jīng)驗公式），溫度越低，生化反應(yīng)速率越慢。因此，樣品保存的溫度越低，保存的時間就越長，在 4℃ 時存活時間只有數(shù)小時的生物樣本，在 -80℃ 下可以保存數(shù)月，在 -196℃ 下，隨著反應(yīng)速率近乎于 0，能保存數(shù)世紀。目前，低溫保存技術(shù)是各類生物樣本長期保存的唯一可行途徑。
俄羅斯科學家曾經(jīng)利用冰凍在西伯利亞科雷馬河永凍層里三萬年前的種子，成功培育出一棵植物，打破復(fù)蘇最古老植物種子的記錄。利用現(xiàn)代低溫冷凍保存技術(shù)，低溫技術(shù)在新興的醫(yī)學前沿領(lǐng)域，如人類精子、卵子及胚胎長期保存已成為現(xiàn)實?？梢哉f，低溫冷凍保持創(chuàng)造了一個又一個生命奇跡。低溫冷凍保存技術(shù)，極大地推動了臨床醫(yī)學的發(fā)展。
對具有較高醫(yī)療價值的生物樣品來說，低溫保存有助于滿足相關(guān)需求。然而，目前很難有效地對大尺度組織和器官進行冷凍保存。隨著體積增大，細胞種類增多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜性增大，對生物系統(tǒng)從微觀到宏觀的多尺度精準控冰要求越來越高。因此，很有必要借鑒耐寒動物的抗冰策略，從物質(zhì)與能量傳遞的角度全面解讀和發(fā)展仿生型低溫冷凍保存技術(shù)。
（來源：Trends in Biotechnology）
低溫保存的技術(shù)路徑有待全面考慮
此前的低溫保存方法分為三類：靜態(tài)冷藏、慢速冷凍（緩慢冷凍/快速解凍）和玻璃化凍存。
靜態(tài)冷藏是臨床器官保存的主要方法，通過將器官保持在 4°C 來降低其代謝速率。然而，保存時間一般限制在 24 小時之內(nèi)，典型器官如心、肺低溫冷耐受時間約為 4 小時，這會使得珍貴的供體器官由于運輸、手術(shù)的時間超出耐受冷缺血時間而不得不被廢棄。
許多細胞和簡單組織通常借助緩慢冷凍/快速解凍的手段，通過程序降溫保存在?196°C，但這個過程需要根據(jù)樣本傳熱傳質(zhì)特征平衡降溫與升溫過程的冰晶損傷與溶液損傷，否則有可能造成不可逆冷凍損傷。
而玻璃化凍存目前主要用于敏感細胞，譬如卵母細胞和干細胞。由于固有的低傳熱速率以及高濃度低溫保護劑的毒性，該方法對于大體積生物樣品見效甚微。由于不受控制的新陳代謝或冰晶損傷，目前仍不能按需獲得高質(zhì)量的器官。
當生物樣品被低溫保存時，樣品的生理、熱學及力學性能是相互關(guān)聯(lián)的。因此，有必要全面考慮低溫保存的技術(shù)路徑。
（來源：Trends in Biotechnology）
首次利用液氦，實現(xiàn)干細胞-269°C 低溫保存
到目前為止，即使是最先進的超低溫保存方案，也不能在有冰形成的情況下保證器官完整性。
大自然中的耐寒動物，給饒偉團隊提供了靈感。這類動物通過調(diào)節(jié)生物系統(tǒng)來對抗低溫脅迫，對于從生化或生物傳熱學角度解決低溫保存問題，這是很好的參考。
該研究展示了耐寒動物的生存策略：冬眠動物通過減緩代謝速率以節(jié)約能量并減輕缺血損傷；冷凍避免型動物采用過冷來防止或減輕冰晶帶來的損傷，而冷凍耐受動物則可以忍受部分體液結(jié)冰，通過在較高溫度下觸發(fā)胞外冰的形成來避免傷害更大的胞內(nèi)冰形成，從而將冷凍損傷降至最低。
此外，該研究還討論了受天然抗凍機制啟發(fā)的材料和技術(shù)。為了實現(xiàn)與冰共存，具備高生物相容性的低溫控冰保護劑必不可少。天然的低溫保護劑，如海藻糖、脯氨酸以及它們的衍生物，在保存生物樣本上具有巨大潛力。
進一步地，該工作首次闡述了耐寒動物的抗寒機制與先進的低溫保護技術(shù)之間的關(guān)系。通過模仿自然界中耐凍或避凍生物的耐寒機制，有望建立新的低溫保存方法。
（來源：Trends in Biotechnology）
據(jù)悉，對于冰晶生長的精準調(diào)控，是減少細胞冷凍保存損傷的基礎(chǔ)。簡單來說，要想低溫保存就得精準控制細胞內(nèi)外結(jié)冰的時空分布。饒偉研究團隊提出了普適性的分子靶向控冰新策略，目前可以實現(xiàn)在單細胞特定位點冰晶成核與冰晶生長的精準調(diào)控，從而實現(xiàn)細胞內(nèi)外的選擇性控冰[2]。
進一步的，在拓展研究中，饒偉首次利用液氦（?269 °C）進行了包括人胚胎干細胞在內(nèi)的多種干細胞的低溫保存，突破了現(xiàn)有干細胞低溫保存溫度極限（-196 °C）并繪制了液氦保存的熱力學過程圖。
在自然界中，一些大體積的動物不僅依賴于來自外部環(huán)境的熱傳導，并且通過化學能產(chǎn)生熱量以提高新陳代謝率，這一過程有助于均勻、快速地重新升溫，以避免再結(jié)晶。
對木蛙解凍的 1 小時磁共振成像顯示，木蛙的所有區(qū)域幾乎同時解凍?？焖?、均勻的解凍可保證較低的熱機械應(yīng)力，減少缺血-再灌注損傷。
受這種生物調(diào)控的解凍過程的啟發(fā)，納米顆粒低溫保護劑被開發(fā)出來，作為外部物理場驅(qū)動的自加熱種子，可以實現(xiàn)快速和均勻的復(fù)溫加熱，而不是完全依賴于從表面到組織深處的熱傳導。
這種納米加熱方法不僅能顯著提高升溫速率，減少所需的低溫保護劑數(shù)量，還可以消除溫度的不均勻性，以減少溫度梯度產(chǎn)生的熱應(yīng)力所導致的開裂損傷。
（來源：Trends in Biotechnology）
研究中，目前給冷凍實驗提供復(fù)溫能量的方法主要有兩種：射頻和激光。
射頻納米加熱，指的是利用磁性納米顆粒，將射頻能量轉(zhuǎn)化為熱量，從而去加熱生物樣本。這種基于超順磁、或鐵磁機制的感應(yīng)加熱方法，可通過降低機械應(yīng)力和再結(jié)晶來擴大低溫冷凍體積。
而激光再加熱則利用具有高吸收系數(shù)的納米粒子將近紅外光的能量轉(zhuǎn)化為熱。
在一項實驗中，饒偉團隊合成了具有高光熱轉(zhuǎn)換效率的柔性液態(tài)金屬納米顆粒，并使用激光照射加熱玻璃化的人骨髓間充質(zhì)干細胞和小鼠尾巴。
其中，干細胞的存活率高達 78%，而常規(guī)方法只有 25%，并且重新加熱的小鼠尾巴的血管中包含一個完整的組織結(jié)構(gòu)。
可以說，激光納米加熱可迅速加熱相對較小體積的生物樣本，比如胚胎和細胞懸浮液。而射頻納米加熱有望實現(xiàn)大體積生物系統(tǒng)的復(fù)溫，例如腎器官。
每年拯救幾百萬性命，價值之高不亞于治愈癌癥
細胞、組織和器官等生物樣本，在醫(yī)療系統(tǒng)中具備巨大價值，可用于藥物發(fā)現(xiàn)、不孕不育癥、創(chuàng)傷、再生醫(yī)學、移植等領(lǐng)域。
器官等生物樣本的臨床應(yīng)用，還可創(chuàng)造巨大的公共衛(wèi)生效益，并在全球范圍內(nèi)每年拯救幾百萬性命，這與治愈癌癥不相上下。最近，美國國家科學基金會投資 2600 萬美元，以用于開發(fā)細胞、組織、器官及活體等生物系統(tǒng)的先進低溫保護技術(shù)。
仿生自適應(yīng)低溫保存技術(shù)，有望為微小生命活體的生物樣本庫保存提供標準化冷凍方案和標準，為保護生物多樣性提供技術(shù)支撐。饒偉團隊通過喂飼仿生保護劑及低溫自適應(yīng)馴化，成功將冷凍敏感型日本弓背蟻轉(zhuǎn)化為冷凍耐受型，馴飼后的螞蟻在冷凍條件下的存活率相比較對照組增加了兩倍多，實現(xiàn)了目前最大尺度的非耐寒活體低溫自適應(yīng)保存與復(fù)活[3]。
饒偉團隊發(fā)現(xiàn)的系列低溫保護新材料以及新技術(shù)，可為器官長期低溫保存提供理論和技術(shù)支持，如此或可改變目前 70% 以上心/肺器官，因為輸運、手術(shù)時長超過器官冷缺血耐受時間而導致的供體器官廢棄現(xiàn)象。
（來源：Trends in Biotechnology）
饒偉表示，活體大腦中的記憶等功能能否通過解凍進一步復(fù)蘇，仍需進行系統(tǒng)的研究。目前該團隊正在做螞蟻在經(jīng)歷凍存和復(fù)活后記憶能否保存的工作，初步結(jié)果非常樂觀。
她和團隊博士生竇蒙家在凍存前，對螞蟻的嗅覺進行了特殊的獎勵訓練，使得訓練后的螞蟻對特定的氣味保持傾向性。之后，對螞蟻進行低溫凍存和常溫下復(fù)活之后，其發(fā)現(xiàn)復(fù)活后的螞蟻仍然保持著對特定氣味的記憶能力。
對于此次論文，她總結(jié)稱，雖然分別討論了不同的生物樣本低溫保存方法，但它們在實際情況下面臨著同樣的挑戰(zhàn)，如多尺度精準控制冰核形成和冰晶生長，以及避免缺血-再灌注損傷的需要。
“科研于我，猶如心底一抹深紅”
饒偉說，做低溫保存研究需要有一顆“強大的心臟”，尤其是挑戰(zhàn)大尺度異質(zhì)異構(gòu)生物體保存時，因為絕大部分實驗都是失敗的，無法實現(xiàn)具備完整功能的生物體成功復(fù)活。而活體的低溫保存，更是充滿了不確定性，其中做螞蟻凍存和復(fù)活的實驗過程是很難忘的。
螞蟻本身是非耐寒的生命體，受季節(jié)影響，螞蟻的生活習性和行為模式變化也比較明顯。由于北京的四季溫差較大，饒偉團隊在進行螞蟻活體低溫保存實驗時，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)凍存之后的存活率隨季節(jié)波動較大。
尤其是冬季，訂購的螞蟻往往在運輸?shù)耐局杏捎诓荒褪艿蜏鼐桶l(fā)生了大概率死亡。為了確保實驗數(shù)據(jù)的一致性，螞蟻的馴飼和低溫適應(yīng)實驗只能安排在特定的季節(jié)來進行。所以，獲取一組成功的實驗往往周期特別長。
研究雖苦，但卻是饒偉心之所愛。
饒偉讀本碩時，學習暖通空調(diào)專業(yè)，更注重工程設(shè)計能力，很多同學畢業(yè)后去設(shè)計院做暖通設(shè)計師。她更喜歡每天都挑戰(zhàn)不一樣的事物，讀博之前非常想換方向。當時得知中科院理化所劉靜教授從事生物傳熱學方向，能把傳熱傳質(zhì)的基礎(chǔ)知識與探索生命奧秘結(jié)合，感覺是一個特別奇妙的領(lǐng)域。
她表示：“讀博時，我探索了利用堿基液態(tài)金屬的熱化學治療機理。在美國的兩站博后期間，又拓展到材料學和分子生物學等方向。科研的確是一場不設(shè)限的奇妙‘旅行’。而我目前所在團隊，又能把實驗室前沿技術(shù)快速轉(zhuǎn)化并實現(xiàn)臨床應(yīng)用。此前，我們曾利用‘冷凍保存’的反作用‘冷凍破壞’去治療腫瘤，開發(fā)的低溫治療裝備已在全國100多家醫(yī)院實現(xiàn)臨床應(yīng)用。一路從博士、到博士后、再到老師，在不同航道上劃著生命行舟逆水而上。路上平平仄仄動蕩往復(fù)，卻也燦爛驚心搖曳生姿?？蒲杏谖?，猶如心底一抹深紅，意味著最重的分量。”
-End-
參考：
1. Dou, Mengjia, Chennan Lu, and Wei Rao. “Bioinspired materials and technology for advanced cryopreservation.” Trends in Biotechnology (2021).
2. Hou Y. Sun X.Y., Liu J. Rao W.*, Cellulose Nanocrystals Facilitate Needle-like Ice Crystal Growth and Modulate Molecular Targeted Ice Crystal Nucleation. Nano Letters, 2021, 21, 11, 4868–4877
3. Dou M.J.＃, Li Y.Z.＃, Sun Z.Q., Li L.*, Rao W.* L-proline feeding for augmented freeze tolerance of Camponotus japonicus Mayr. 2019. Science Bulletin. doi.org/10.1016/j.scib.2019.09.
來源：麻省理工科技評論
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